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        锇酸染色法

        相关实验:耳的形态学检测实验

        最新修订时间:

        简介

        锇酸染色也是常用的分析毛细胞和螺旋神经节形态数量的染色方法。

        材料与仪器

        器材:水平摇床、加热切片机、玻璃刀片、通风橱

        试剂:

        ① Epon-Araldite mix(每毫升的 Epon 混合液加入 20 g 顺丁烯二酸二丁酯(DBMA)混匀,真空放置 2 小时或直至泡沫消失。配方见表 8-12-1。)


        锇酸染色法


        ② 梯度丙酮


        ③ PBS

        ④ 脱钙液(含 0.35 mol/L EDTA 的 PBS)

        ⑤ 道尔顿缓冲液(含 0.25% 四氧化锇)

        步骤

        锇酸染色法的基本过程可分为如下几步:

        A. 耳蜗样品用 PBS 清洗 3 次,水平摇床每次 10~20 分钟。

        B. 每个样品小管中加入 1~3 ml 脱钙液(含 0.35 mol/L EDTA 的 PBS),放 4 ℃ 水平摇床上脱钙 3~5 天。

        C. 样品放在旋转器上用 PBS 清洗 3 次,每次 10~20 分钟。同时准备 Epon-Araldite 混合液。

        D. 将水平摇床放入通风橱。

        E. 每个样品管中加入 1 ml 含 0.25% 四氧化锇(OsO2)的道尔顿缓冲液,水平摇床上放置 15 分钟。

        F. 将四氧化饿(OsO4)倒入有毒废液罐。

        G. 水平摇床上用 PBS 清洗样品 3 次,每次 10~20 分钟。第一次清洗的 PBS 要倒入有毒废液罐。

        H. 清洗样品(旋转器上,通风橱外)

        50% 的丙酮清洗 15 分钟;

        80% 的丙酮清洗 15 分钟;

        95% 的丙酮清洗 15 分钟;

        100% 丙酮清洗 15 分钟;

        100% 丙酮清洗 15 分钟;

        丙酮:环氧树脂按照 2:1 混合,1 小时;

        丙酮:环氧树脂按照 1:1 混合,1 小时;

        丙酮:环氧树脂按照 1:2 混合,2 小时(也可室温过夜)。

        I 每个样品加入 2~3 ml 环氧树脂混合液,真空中放置 1 小时或直到泡沫消失。4 ℃ 旋转器上过夜。

        J. 第 2 天,将含样品的旋转器转移到室温放置 1 小时。同时配制新的 Epon-Araldite 混合液。

        K. 每个样品加入新的 Epon-Araldite 混合液,旋转 2 小时。

        L. 重新加入新的 Epon-Araldite 混合液,旋转 2 小时。

        M. 打印标签。

        N. 将样品和对应的标签以正确的位置放到模具中。

        O. 65 ℃ 恒温箱放置 48~72 小时。完成后可用加热到 80 ℃ 左右的热刀片进行切片。结果见图 8-12-10。

        锇酸染色法

        来源:丁香实验

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