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        细胞的集落形成实验

        相关实验:细胞的集落形成实验

        最新修订时间:

        简介

        造血生长因子是一类主要作用于造血系统的细胞因子的总称。造血细胞的存活、增殖及分化离不开造血微环境中的造血生长因子。


        因此,在研究造血过程时,对造血生长因子的检测是必不可少的。集落形成实验同 ELISA 及细胞增殖实验相比较,不但能反映细胞因子水平,还能反映不同生长因子对集落形成类别的影响。

        材料与仪器

        器材:


        ① 35 mm 细胞培养皿(悬浮细胞用)


        ② 10 cm 细胞培养皿


        ③ 手术器械


        ④ 1 mL 注射器


        试剂:

        ① 甲基纤维素半固体培养基 MethoCult(Stem Cell Technology 03334);

        ② 1x PBS(NaCl 137 mmol/L,KCI 2.7 mmol/L,Na2HPO,10 mmol/L。

        步骤

        细胞的集落形成实验的基本过程可分为如下几步:


        A 无菌条件下收获胎肝细胞并用注射器分离成单细胞悬液。


        B 细胞计数。


        C 按照最终细胞接种密度的 10x 浓度配制细胞悬液。


        D 实验设置 2 个副孔的话,将 0.3 mL 细胞液和 3 mL 甲基纤维素培养基混匀。


        E 每个 35 mm 培养皿分装 1.1 mL 甲基纤维素细胞培养液。


        F 每个 10 cm 培养皿里放 2 个 35 mm 培养皿和一个不加盖子的 35 mm 培养皿。不加盖子的 35 mm 培养皿里加 3 mL 灭菌水,以保湿并减少污染的风险。


        G 将培养皿置于 37 ℃,5% CO2,湿度>95%。


        H 对 CFU-E 而言,2 天后可以在显微镜下对造血克隆计数;对 BFU-E 而言,7~10 天后可以计数。


        I 图 8-8-2 为各组织正常情况下的 BFU-E,CFU-GM,CFU-GEMM 的数目。

        细胞的集落形成实验

        注意事项

        1. 隔夜融化甲基纤维素培养基。


        2. 无菌操作,试剂和耗材都应事先灭菌。


        3. 也可以用磁珠或 FACS 分选等方法对细胞进行筛选后,再种植于甲基纤维素培养基上。


        4. 为保持干\祖细胞活性,整个操作过程应尽量快,以减少对细胞活性的损伤。


        5. 可在甲基纤维素中加入不同的细胞因子,以检查干\祖细胞向不同终末分化细胞分化的能力;StemCell Technologies 公司有加了不同生长因子的甲基纤维素培养基可供不同的实验目的。


        6. 可以用 Benzidine 染色来帮助鉴别 BFU-E 和 CFU-E 克隆。


        7. 图 8-8-1 显示了其他克隆的外形,以供鉴别。

        细胞的集落形成实验

        来源:丁香实验

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