聚集法制作嵌合体大鼠

嵌合体（chimera）在遗传学上用于指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体；在免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排斥反应，相互间处在嵌合状态。

人工地将两个或两个以上具有不同遗传性状的早期胚胎或把具有特种遗传性状的细胞和早期胚胎聚合或显微注射所产生的个体称之为嵌合体动物（chimeras）。嵌合体的广泛应用得益于胚胎干细胞技术的发展。

制作嵌合体动物主要有两种方法：聚合法和显微注射法。聚合法是指将去透明带的两个或多个早期胚胎聚集或者将胚胎与多能性干细胞聚集，形成一个嵌合胚胎，移植后获得嵌合体动物的方法。

聚集法制作嵌合体大鼠的基本过程可分为如下几步：

1．聚合用液滴和去透明带液滴的制备

（1）在聚合实验前1天，制作聚集板和胚胎培养板。在直径60 mm的Faleon组织培养皿上用圆头锥子压制30个小窝，将15 μl的KSOM液滴置于每个小窝上，用液体石蜡覆盖后于培养箱中过夜平衡。

（2）在实验当天，制作一个由多个M2液滴和酸性台氏液（acidified Tyrode＇ssolution）液滴组成的培养皿，并用液体石蜡覆盖。

2．受体胚胎的准备

（1）超排处理的大鼠与同品系雄性大鼠进行交配，次日见栓记为0.5dpc。

（2）在交配后56小时左右（取8-细胞期胚胎），用颈椎脱白法处死大鼠、

（3）仰卧固定于实验台上，用乙醇喷雾小鼠腹部，进行表面消毒。

（4）打开腹腔，连同子宫一起采取输卵管，再剪下输卵管准备灌流。

（5）一般用带有26～30号针头的1ml注射器，吸取含有HASE的HERs培养基300 μl进行输卵管灌流，灌流后带有胚胎的培养基滴入培养皿中。

（6）挑选优质胚胎转移至事先准备的KSOM滴中。

3．聚合用ES细胞的准备

（1）在注射前2小时给ES细胞换上新鲜的培养基。

（2）移去培养基，用PBS洗两遍。

（3）加入适量的0.05％ 胰蛋白酶，在37 ℃、5％ CO₂培养箱中孵育10-15分钟。

（4）加入适量的ES细胞培养基，终止消化。轻轻用巴氏吸管吹打三四次，将细胞吹散成单细胞悬液。

（5）将细胞悬液移到一新的预先铺盖0.1％ 明胶的组织培养皿中，放回37 ℃、5％ CO₂，培养箱中孵育20～30分钟。

（6）轻轻拿出培养皿，收集含有ES细胞的全部培养基，留下贴壁的MEF细胞。

（7）将最后收集的培养基移入15 ml离心管中，1000 r／min离心5分钟。

（8）弃上清，用500 μl培养基重悬，并轻轻吹打成单细胞悬液。

（9）冰上放置15分钟，吸走2／3上清，然后补回500 μl培养基；将细胞放冰上待用。

4．ES细胞与二倍体胚胎聚合

（1）将在KSOM中待用的胚胎从KSOM中转移到去透明带平皿的M2液滴中，然后将一个胚胎从M2中移入到一滴台氏液中，观察透明带是否溶解，当透明带即将完全溶解时将胚胎移入一新的M2液滴中，同时用手吸管吹打胚胎，再将胚胎移到新的M2液滴。

（2）每个胚胎都同样处理，并且不要让胚胎相互接触。将去透明带的胚胎在平衡好的KSOM中洗涤3遍，把无透明带的胚胎单个放到聚集皿的小孔内，每个小孔只放一个胚胎。

（3）取200 μl的ES细胞悬液，在显微镜下选择6～15个细胞的细胞团，把细胞团移到平衡好的KSOM中。

（4）将挑选出来的ES细胞团放在聚集皿的小孔中，与孔中的每个胚胎接触。

（5）将聚集的ES细胞和胚胎放入37 ℃，5％ CO₂的培养箱中培养24小时。

（1）用于培养的KSOM液滴需提前一天在培养箱中进行平衡。

（2）ES细胞吹散时要轻轻吹打，避免剧烈吹打把ES细胞吹成单细胞或吹死。

（3）ES细胞消化后要在3～4小时内使用，并放置于冰上，保持细胞有较好的状态。

（4）胚胎去透明带时，需在透明带还未消化完全时就从台氏液中移到M2液滴中，避免酸性台氏液度胚胎造成过度损伤。

（5）在去透明带后，胚胎很容易受到外界不利环境的影响，因此在胚胎的转移和清洗时必须小心谨慎。