125I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性

目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。¹²⁵I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性是依据 ¹²⁵I 的物理半衰期来检测细胞活性。

¹²⁵I-UdR 释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本原理是 ¹²⁵I-2＇脱氧尿嘧啶核苷（¹²⁵I-UdR）是胸腺嘧啶核苷的类似物，作为 DNA 合成的前体物，它能相当特异地取代胸腺嘧啶核苷掺入到细胞核 DNA 链上，¹²⁵I 的物理半寿期为 59.7 天。因此，可用 ¹²⁵I-UdR 标记体外传代培养的靶细胞，以外周血分离的单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，进行体外 NK 细胞活性检测。被效应细胞杀伤的靶细胞可释放 ¹²⁵I-UdR，用 γ- 计数仪测定其放射性强度，以 ¹²⁵I-UdR 释放百分率表示 NK 细胞的活性。

1、效应细胞的制备

常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。

2、靶细胞的制备

取培养 24～48 小时的靶细胞 1 ml（5x105/ml），分别加入 5-FudR 4～6 μl 和 ¹²⁵I-UdR 6 μCi，混匀，置 37 ℃ 培养 2 小时，取出后用含 5％ NCS 的 RPMI 1640 培养液洗涤 3 次，每次离心 1500 r/min，2 分钟，最后用完全 RPMI 1640 培养液悬浮，计数活细胞。用 γ- 计数仪检测标记率，一般可达 1～2 cpm/细胞。

3、效-靶细胞作用

调整效应细胞和标记的靶细胞浓度，分别加入塑料试管中，效／靶细胞比例为 12.5:1～100:1。同时设只加标记靶细胞的自然释放对照管（同5＇Cr法），每份标本和对照管均设 3 个复管，每管均用完全 RPMI 1640 培养液补足体积至 1 ml，混匀，离心 1500 r/min，2 分钟，以促进效-靶细胞作用，置 37 ℃、5％ CO₂ 温箱中培养 18 小时。

4、酶处理

取出效／靶细胞培养物，1500 r/min，离心 2 分钟，弃上清，于每管中加入胰蛋白酶（用无 Ca2＋、Mg2＋的 Hanks 液配制成 3 mg/ml，小量分装，-20 ℃ 冻存）和 DNA 酶（用 Hanks 液配成 50 μg/ml，小量分装，-20 ℃ 冻存。）各 0.1 ml，混匀后置 37 ℃ 水浴 30 分钟，促使已受损伤的靶细胞释放 ¹²⁵I-UdR，然后于各管中加入 0.8 ml 冷 Hanks 液，以终止酶反应。1500 r/min 离心 2 分钟，分别吸出各管上清 0.5 ml 置于另一个塑料试管中。

5、放射性测量和结果计算

用 γ- 计数仪分别测量每管上清和细胞部分的 cpm 值，并按下式计算 ¹²⁵I-UdR 释放率和 NK 细胞活性，取三管均值作为 NK 细胞活性。