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        人蜕膜基质细胞的分离及纯化

        相关实验:人蜕膜基质细胞的分离及纯化

        别名:decidual stromal cell,DSC

        最新修订时间:

        简介

        子宫内膜蜕膜化是胚胎着床及成功妊娠的关键步骤。蜕膜组织的细胞成分相当复杂,其中蜕膜基质细胞约占全部蜕膜细胞数的75%,是母胎界面的主要组成细胞。


        这些细胞起源于间质的成纤维细胞,形态较大,呈多边形,高水平分泌催乳素(prolactin,PRL)等多种激素,参与蜕膜的营养供应和内分泌微环境的形成。


        胞质内富含波形蛋白,不含细胞角蛋白(cytokeratin 7,CK7),可用作蜕膜基质细胞的鉴定。

        原理

        人蜕膜基质细胞的分离及纯化的基本原理是来源于间质的DSC可通过调节蜕膜免疫细胞的功能参与维持母胎免疫耐受,从流产组织中取出较厚实的蜕膜,通过酶消化后研磨过滤,并进行密度梯度离心。


        根据细胞的密度可以吸取20% ~40% 密度层初步获得DSC,通过短期培养去除悬浮细胞进一步纯化DSC。


        然后根据细胞群的形态、表型及功能特点,利用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定;通过体外传代培养的方法获取大量、纯度较高的DSC,为更深入的研究细胞在母胎耐受中的作用提供基础。

        材料与仪器

        试剂:


        PBS溶液、D-Hanks溶液、RBC裂解液


        RPMI 1640细胞培养液、DMEM/F12培养液


        胎牛血清、胰蛋白酶、胶原酶IV型、DNA酶I型


        Percoll 原液、抗生素


        仪器:


        眼科剪,镊子,不同规格筛网(100目)


        各类培养皿,注射器柄,不同规格塑料离心管


        1.5 ml EP管,吸管,台式冷冻离心机


        磁极及磁珠分选柱,CO2孵育箱,水浴摇床,流式细胞仪。

        步骤

        人蜕膜基质细胞的分离及纯化的基本步骤可分为以下几步:


        1.挑取厚实的蜕膜组织,在预冷的D-Hanks液中反复冲洗,吹打清除血污后将干净组织置于无菌培养皿中,用眼科剪剪碎成1 mm3组织块。


        2.加入0.1% 胶原酶IV(或与50 μg/ml DNase I合并消化组织)于37 ℃水浴振荡消化1小时后,用含10% FBS的DMEM/F12细胞培养液终止消化。


        经100目筛网研磨过滤,获得的细胞悬液300 g离心10分钟,弃去上清。


        3.将细胞团重悬于3 ml D-Hanks液中,小心铺于不连续Percoll密度梯度界面(60%、40%、20% 三种梯度),1000 g离心20分钟。


        4.吸取20% ~40% 梯度层之间的细胞(p=1.031~1.056),即为初步分离的DSC,洗涤后重悬于含10% FBS的DMEM/F12细胞培养液中。


        5.所获细胞置37 ℃、5 %CO2培养箱中培养30分钟后换液,去除悬浮细胞,贴壁细胞即为纯化的DSC。


        6.将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养5~7天后,当培养瓶中的细胞铺满瓶壁,融合度达80% 时可传代。


        先弃去培养液,D-Hanks液轻洗2次,加入消化酶液2 ml消化细胞2分钟后,倒置显微镜下观察90% 细胞变圆,加入2 ml FD完全培养液终止消化。


        并用吸管反复吹打制成单细胞悬液,分别接种于新的培养瓶中,于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱继续培养传代。


        7.根据波形蛋白阳性,CK7阴性的特点对细胞进行免疫组织化学鉴定。

        注意事项

        1.根据各自实验室的实际情况,对蜕膜组织进行消化亦可采用0.25% 胰蛋白酶和0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)按1:1比例配制的消化酶液,于37 ℃恒温水浴锅中震荡消化20分钟。


        2.可利用妊娠初期DSC高度分泌PRL的特点,进行PRL免疫组织化学对细胞鉴定。

        来源:丁香实验

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