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        石蜡切片技术(组织学基本技术)

        相关实验:组织学基本技术

        别名:hematoxylin-eosin staining ,HE染色,苏木精 — 伊红染色法

        最新修订时间:

        简介

        石蜡切片技术是利用石蜡替代组织内的水分,从而可制成切片,并良好地保存组织和细胞的结构。

        原理

        石蜡切片技术的基本原理是新鲜人体或动物组织含有水分,经石蜡处理后,石蜡替代了组织内的水分,从而可制成切片,并良好地保存组织和细胞的结构。

         

        材料与仪器

        器材:

        仪器与材料 恒温干燥箱、石蜡切片机、展片盒、烤片机、拨针、标本瓶、标签纸、滤纸、镊子、刀片、量筒、漏斗、滴管、酒精灯、切片刀、小木块(或蜡块托)、蜡铲、载玻片、毛笔、切片盒、切片架、蜡杯、浸蜡盒、包埋盒。

        试剂:

        ① 固定液。多采用 10% 甲醛水溶液。取 10 ml 甲醛再加入蒸馏水 90 ml;

        ② 70% 乙醇。取 95% 乙醇 70 ml 再加入蒸馏水 25 ml;

        ③ 85% 乙醇。取 95% 乙醇 70 ml 再加入蒸馏水 10 ml;

        ④ 95% 乙醇(原装);

        ⑤ 100% 乙醇(原装);

        ⑥ 二甲苯(原装);

        ⑦ 切片石蜡(熔点为 54~62 ℃);

        ⑧ 蛋白甘油:取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合,至均匀为止。加入约为 1% 量的麝香草酚(一小粒),借以防止微生物的侵入和腐败。置冰箱备用。

        步骤

        1、取材与固定

        根据不同的实验目的,选择相应的组织材料,及时投入盛有固定液体的标本瓶中。固定液的用量一般为材料的 10~15 倍或稍多,常规固定时间为 12~48 h。

        2、打开恒温干燥箱调至 62 ℃(熔蜡)

        (1)放入两个盛有适当熔点石蜡的蜡盒使蜡熔化,组编为(Ⅰ)号、(Ⅱ)号。

        (2)放入盛有适当熔点石蜡的蜡杯使蜡熔化(包埋备用蜡)。

        3、脱水与透明步骤

        (1)倒出固定液。
        (2)70% 乙醇,1~2 h(根据组织块大小而定)。如不及时使用,可放入冰箱 4 ℃ 保存。如间隔时间较长,可在乙醇中加入适量甘油,再放入冰箱中保存。
        (3)85% 乙醇 1~2 h(根据组织块大小而定)。
        (4)95% 乙醇,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共 1~2 h(根据组织块大小而定)。
        (5)100% 乙醇,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共 1~2 h(根据组织块大小而定)。
        (6)二甲苯,为保持浓度稳定,中间更换一次同等液体,两次共 40 min~2 h(根据组织块大小而定)。

        4、浸蜡

        透明的组织从二甲苯中取出,立即放入(Ⅰ)号蜡盒,0.5 h 后放入(Ⅱ)号蜡盒,一般为 1~1.5 h(根据组织块大小而定)。

        5、包埋

        将熔化蜡倒入包埋盒,用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置,待石蜡全部凝结变硬即可取出。

        6、修切蜡块

        把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形,注意勿太靠近组织,让组织四周留有少许石蜡,蜡块两边必须切成平行的直线,以免切下的蜡条弯曲。

        7、固定蜡块

        取小木块,用蜡铲在酒精灯上加热,使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上,冷却后装在切片机上。

        8、载玻片

        取干净的载玻片涂以甘油蛋白:以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴,轻轻滴于载玻片中央,常以洗净的手指加涂布,涂布的面不宜太广,而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多,否则,会形成白膜,妨碍观察。

        9、切片

        在开始切片前,先熟悉切片机的构造和用法,装上切片刀,注意刀倾角不宜过大,亦不宜过小,大致上以 20~30 ℃ 为宜。如倾角过大,则切片上卷,过小,则切片皱起。

        10、贴片

        蜡带受热即自动展开,也可用拨针轻轻拉开。待蜡片完全展平后,用滤纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡,否则在展片时气泡会扩大,甚至致使切片破损、变形,影响组织观察。

        11、烤片

        将贴片置入 37~62 ℃ 恒温干燥箱干燥 12 h。干燥后片子常温、阴凉处保存待实验时用。

        注意事项

        1、组织要求新鲜,避免挤压,挫伤和干枯。固定时间根据组织块大小而定。

        2、在 85% 乙醇内组织可保留较久,如果当天来不及做完,可暂保存一晚,第二日再做。

        3、组织放入二甲苯后,待组织块透明后,立即浸蜡,外曝露时间过长组织易干。

        4、浸蜡以前,先做好准备工作,恒温干燥箱中分装在(I)号、(II)号蜡盒的石蜡应已完全熔化,保持恒定。

        5、蜡片出现裂隙或碎裂可能与组织浸蜡不足,或浸蜡温度过高,或在透明剂中时间过久有关,组织易发脆。

        6、蜡片厚薄不一可能与刀或蜡块未固定牢,切片机磨损发生故障有关。

        7、蜡片卷起可能与刀口太钝或不清洁,刀的角度过大或石蜡过硬有关,试用手温或温水在蜡块上轻涂布一下。

        8、蜡片易粘在切片刀上或蜡片皱缩可能与室温过高、刀的角度过小或石蜡太软有关,试用冰块冰一下即可。

        9、蜡带弯曲可能与蜡块上下不平行,刀钝,蜡块不与刀刃平行有关。

        10、切片注意事项:

        a.调整刻度指针到要求的厚度,一般要求 5~8 μm,切片刀要拭净;

        b.用右手摇切片机转轮,左手持毛笔托住蜡带,转动切片机时不可太快,用力宜均匀,不可时快时慢,防止机器振动太厉害,以致切片厚薄不均匀;

        c.用毛笔托住蜡带,放在展片盒内(水温宜在 48 ℃ 左右)展片。

        来源:丁香实验

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