多潜能干细胞的诱导

相关实验：多潜能干细胞的诱导

别名：in-duced pluripotent stem cells，iPS

最新修订时间：2022-02-10

简介

多潜能干细胞（in-duced pluripotent stem cells，iPS）技术不仅可以解决胚胎干细胞来源引起的伦理问题，而且自体 iPS 细胞可以避免异体来源胚胎干细胞移植引起的免疫排斥反应。目前就成体细胞诱导产生 iPS 细胞相关的几种转录因子以及诱导方法、如何提高诱导产生 iPS 细胞的效率以及 iPS 细胞临床应用方面都是在 Yamanaka 报道的诱导方案基础上的改良。

原理

Yamanaka 法诱导多能干细胞的原理是把 Oct3/4，Sox2、c-Myc 和 Klf4 这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的 iPS 细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

材料与仪器

器材：

① 37 ℃ 水浴锅

② 一次性无菌培养皿

③ 一次性无菌移液管

④ T75 培养瓶

⑤ 涂有明胶的 6 孔板

⑥ 15 ml 离心管、注射器和针头

试剂：

① 材料：提前制备好的饲养层细胞

② DMEM 培养基

③ 胎牛血清

④ 谷酰胺

⑤ 非必需氨基酸

⑥ DF12 培养基

⑦ 血清替代物

⑧ 谷酰胺＋2-巯基乙醇溶液

⑨ b-FGF 溶液

⑩ β-巯基乙醇

步骤

多潜能干细胞的诱导的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）MEF 培养基的配制 DMEM 培养基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 热灭活 30 min），50 ml；200 mmol/L-谷酰胺，5 ml；非必需氨基酸，5 ml。将所有组分混合后，用 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃ 保存，保持无菌。

（2）胚胎干细胞培养基的配制 DF12 培养基，200 ml；血清替代物，50 ml；200 mmol/L-谷酰胺＋2-巯基乙醇溶液，1.25 ml；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 ml；b-FGF 溶液，5 ml。所有组分都加入 250 ml 培养瓶中，用 0.22 μm 滤器过滤除菌。培养基最好在 2 周内使用。

（3）200 mmol/L-谷酰胺＋2-巯基乙醇溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺（使用前冷冻保存），5 ml；β-巯基乙醇，7 μl。混匀。

（4）b-FGF 的配制。b-FGF，10 μg；0.1％ BSA 无菌，5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分装，冷冻保存。

（二）开始前准备

（1）小鼠胚胎成纤维细胞的获得通过同源重的方法将双选择标记系统，如βgeo（neo 用于 G418 筛选，βGal 用于显影）基因盒，同源重组到小鼠 Nanog 基因位点，使βgeo 受内源性 Nanog/O）ct 启动子控制，由于 Nanog 只在 ESC 中表达，所以来源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的体细胞由于缺乏 ES 特性，不能在 G418 中生长。按 MEF 制备方法，从 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分离培养 Fbx15βgea/βgeo 来源的 MEF。

（2）经典的「Yamanaka」法 OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC 病毒的准备。

（3）MEF 饲养层细胞的制备。