简介
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同分为微管、微丝和中间纤维。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。微丝是肌动蛋白构成的纤维。单根微丝直径约 7 nm,在光学显微镜下看不到。在不同种类的细胞中,它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构,如肌肉细丝、肠上皮微绒毛轴心和应力纤维等。本实验用考马斯亮蓝 R250(Coomassie brilliant blue R250)显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达,与细胞对培养基质的附着和维持细胞扁平铺展的形状有关。
原理
微丝染色及形态观察实验的基本原理是考马斯亮蓝 R250 可以染各种蛋白,并非特异染微丝。但在该实验条件下,微管结构不稳定,有些类型的纤维太细,光学显微镜下无法分辨。因此,我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维,直径约 40 nm。
材料与仪器
(A 液:NaH2PO4·2H2O,936 mg/1000 ml。B 液:Na2HPO4·12 H2O,2148 mg/1000 ml。工作液:A 液 68.5 ml+B 液 31.5 ml(用 NaHCO3 调 pH 至 6.5)
② M 缓冲液(pH7.2)
(咪唑,3.40 g;KCl,3.71 g;MgCl2·6H2O,101.65 mg;EGTA(乙二醇双醚四乙酸),380.35 mg;EDTA(乙二胺四乙酸),29.22 mg;巯基乙醇(mer-captoethanol),0.07 ml;甘油,292 ml;加蒸馏水至 1000 ml(用 1 mol/LHCl 调 pH 至 7.2))
③ 1% Triton X-100
步骤
(一)动物细胞微丝的显示与观察
(二)植物细胞微丝的显示与观察
注意事项
来源:丁香实验