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        抗原免疫家兔或小鼠制备多克隆血清

        最新修订时间:

        简介

        抗原免疫家兔或小鼠制备多克隆血清是传统的动物免疫血清(也称抗血清)的制备方法。

        材料与仪器

        器材:剪刀、镊子、注射器附针头、动物固定架、手术器械、血管夹、黑丝线、塑料放血管、灭菌三角烧瓶(200 ml)、无菌离心管等。

        试剂:

        ①纯化人 IgG(10 mg/ml);

        ②灭菌生理盐水;

        ③弗氏完全(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)


        步骤

        抗原免疫家兔或小鼠制备多克隆血清的基本过程可分为如下几步,本方法以人 IgG 为抗原,制备家兔抗人 IgG 多克隆抗体

        A. 采集对照用正常兔血清 可在免疫前先采集该家兔的正常血清,以备后续研究中作为阴性对照(如抗体效价检测)。一般可通过前述耳缘静脉采血,取血量约 2-5 ml,收集血清。

        B. 抗原乳化 取纯化人 IgG 与等体积弗氏完全佐剂(第一次免疫)或弗氏不完全佐剂(后续免疫)混匀,充分乳化以达到「油包水」状态。

        C. 免疫初次免疫采用背部皮下多点注射法:于家兔脊柱两旁选 8-12 点皮下注射,每点约 0.05-0.1 ml;间隔 3-4 周后再于上述部位选不同点注射,另加两侧腘窝;一般需连续免疫 3-4 次。最后一次免疫也可无需佐剂,以生理盐水直接稀释抗原后,于耳缘静脉注射免疫。

        D. 效价测定 末次免疫后 1 周,从耳缘静脉取血收集血清,以双向琼脂扩散实验或间接 ELISA 法检测抗体效价,同时以免疫前兔血清作阴性对照。

        E. 大量采血 当抗体效价满足研究者需求(参考值:双相琼脂扩散实验效价>1:16;间接 ELISA 效价>1:6400),即可大量采血,分离纯化抗体。若效价未达到要求,可继续用不加佐剂的抗原(人 IgG)行耳缘静脉内注射免疫,间隔 1 周后再次试血,直至达到要求。


        注意事项

        1. 若要获得好的免疫效果,抗原必须经完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化。但若抗原不纯,佐剂在提高特异性免疫反应的同时,也会辅助抗原中极微量的杂蛋白产生抗体,使免疫血清的纯度受到影响。因此,免疫用抗原最好进行纯化。

        2. 注意每次免疫尽可能不要选择与前次免疫相同或邻近的位点,否则容易形成溃疡且难以愈合,特别是弗氏完全佐剂免疫位点。

        3. 注意耳缘静脉采血每次取血量不要太多,否则会造成家兔贫血。

        4. 免疫后的动物需密切监测其身体的健康状况,若出现超敏反应、皮肤溃烂等问题要及时处理。同时还要加强营养,对家兔,可在饲料喂养的前提下交替辅助给予萝卜或白菜;对小鼠,则给予生瓜子或鸡蛋等,并和实验动物管理人员做好沟通。

        5. 实验中应注意遵守实验动物的操作规范,待实验完成后,遵照使动物最小痛苦的原则处死动物。


        来源:丁香实验

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