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        基本方案

        相关实验:免疫电镜标本固定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 血管灌注固定固定效果最好,能使超微结构得到很好的保存。灌注装置由加压气球、压力表、三通接头和连接管道组成。不同的组织器官必须选择合适的灌注压力,详见有关书籍。灌注固定一般维持 10~15 min。然后用相同的固定液继续浸泡固定 2~4 h。


        2. 浸泡固定组织块切小后立即投入到固定液中,置于 4℃ 固定 2~4 h。游离培养细胞离心后去上清,加入 20 倍体积的固定液,用吸管将细胞团块打散,固定 25~30 min。


        3. 微波固定微波能加速组织内部分子、外部化学物质的运动和扩散。应用微波照射可以缩短固定时间,而且抗原能得到较好保存。一般 700 W 微波照射 10 s,在微波炉内放 1000 ml 的冷水以吸收热量(保持温度在 35℃ 以下),然后继续用固定液固定 2~4 h。

        常见问题

        目前常用免疫电镜标本固定液主要有以下几种。


        1. 多聚甲醛-戊二醛混合固定液(简称 PG 固定液)推荐用 2%~4% 多聚甲醛与 0.5% 戊二醛的混合液,固定时间为 4 h。


        2. 过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液(称 PLP 固定液)配制方法见本书第一章,固定时间为 6~12 h。该固定液选择性地固定糖类,对超微结构及许多抗原的活性保存较好。低浓度的多聚甲醛能稳定蛋白与脂类。


        3. 苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液(称 PAPG 固定液)含 4% 多聚甲醛、15%(体积分数)苦味酸(2,4,6,-三硝基苯酚)、0.5% 戊二醛,pH 7.3。苦味酸穿透力强,对抗原活性影响小。在前固定液中加入苦味酸替代锇酸,能固定蛋白质,改善对膜和胞质的保存。

        常用于包埋后的免疫染色。

        来源:丁香实验

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