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        分析蛋白质混合物

        相关实验:Far Western 分析蛋白质相互作用实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        封闭缓冲液 I: 0.05%(m/V)吐温-20 溶解到 1 × PBS 缓冲液中,新鲜配置

        封闭缓冲液 II: 1 g 牛血清白蛋白(BSA;fraction V)溶解到 100 ml 1 × PBS ,新鲜配置


        1. 准备待分析蛋白样品,将之融解到 1 × SDS 上样缓冲液中。


        2. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本。


        3. 用半干印迹法将蛋白质从胶上转到固体支持膜上(如 PVDF 或者硝化纤维膜))。


        4. 可选步骤:转膜后,用 100 ml 新鲜稀释的 1 × 丽春红 S 染液染膜 5 min。染膜时要用能够容纳膜的足够大的容器,足够多的丽春红 S 染液,能够完全没过膜表面。


        5. 褪色:使用去离子水洗膜数次直至蛋白质能够清晰显现。用铅笔在重要的蛋白条带上做上标记以便以后参考。剪掉膜的多余部分。


        6. 在水中再褪色 5 min 直到红色染料变淡。


        7. 室温下在 200 ml 封闭缓冲液 I 中封闭 2 h,轻轻摇晃。


        8. 轻轻倒掉溶液,加入 200 ml 封闭缓冲液 II。同步骤 7 —样孵育。


        9. 倒掉封闭缓冲液 II,在 100 ml 1 × PBS 中轻轻漂洗。


        10. 下面按厂商步骤制备用 35S-甲硫氨酸放射性标记的目的蛋白的体外翻译探针。


        11. 翻译后,使用 500 W 探针纯化缓冲液稀释,室温下使用微量过滤离心柱 10000 g 离心 15~30 min 纯化探针。保存部分的纯化探针用于 SDS-PAGE 电泳分析(如 2 μl)和闪烁计数(如 2~5 μl)。


        12. 用 50 ml 1 × 探针稀释缓冲液(没有探针)预孵化膜 10 min,室温下伴轻摇。


        13. 用 1 × 探针稀释缓冲液稀释翻译的探针,使其体积足以没过膜(通常 3 ml)。


        14. 将探针加到膜上,室温下孵育 2 h,在结合反应过程中转动试管(若在试管孵育)或摇动封口袋(若在封口袋孵育)。


        15. 将膜转移到一个塑料盘中,室温下使用 200 ml 1 × PBS 洗膜 5 min。


        16. 风干膜,在 X 射线胶片(放射自显影)或者磷屏曝光成像。

        注意事项

        1. 当使用放射性材料时,必须有适当的安全防护措施。


        2. 在接触支持膜时一定要戴手套或者用夹膜钳。

        来源:丁香实验

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