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        凝胶法

        相关实验:内毒素测定实验

        最新修订时间:

        原理

        鲎是一种海洋节肢动物,其血液中的有核变形细胞含有凝固酶原和可凝固蛋白。将这些变形细胞冻融裂解后制成鲎变形细胞溶解物(limulus amebocyte lysate,LAL),此溶解物若与待检标本中的内毒素相遇,内毒素激活 LAL 的凝固酶原成为凝固酶,作用于可凝固蛋白,使其凝聚成凝胶状态,鲎试验是目前检测内毒素最敏感的方法之一,比家兔热原试验敏感 10~100 倍,可测出 0.01~1 ng/ml 的微量内毒素。


        鲎试验在临床上用于革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症、革兰氏阴性细菌性脑膜炎的早期诊断,以及用于药剂、生物制品中的热原检査,是一种快速、简便和离度灵敏的方法。


        鲎试验主要有三种方法:凝胶法、沉淀蛋白法和产色底物法。后二种方法是从凝胶法改进而来,其灵敏度比凝胶法高 5~10 倍以上,可定量测定内毒素的含量,但操作较繁琐。


        下面介绍常用的方法——凝胶法。

        材料与仪器

        步骤

        1. 取鲎试剂一支,按说明加入规定量的无热原的无菌蒸馏水使之溶解。


        2. 取内毒素标准品,用无热原的无菌蒸馏水溶解。


        所用浓度按毎批溶解构的敏感性而定。


        一般稀释至 20 Eu/ml(Eu 为内毒素单位)。


        3. 取 3 支小试管,分别编号,按下表加人各成分并进行操作。
        凝胶法


        4. 孵育结束,将试管从水浴中轻轻取出。


        不要振动试管,以防凝胶破坏,产生假阴性。


        缓缓倒转试管 180°,如凝成固体凝块,为阳性;呈半流动状为弱阳性;仅见混浊度增加,或有少量絮状钧,或无变化,则为阴性。

        注意事项

        因极微量的内毒素即可导致 LAL 凝胶化,本试验所用试管、吸管等均须预先进行去热原处理。玻璃等耐热物品可干热 180 ℃ 以上 2 h 或 250 ℃ 30min,以彻底破坏内毒素;不耐热物品可用双氧水浸泡。

        常见问题

        鲎试验测定内毒素虽敏感,但试验中,下列因素可影响其敏感性:


        1. LAL 试剂的质量,每批试剂的敏感性可有不同,而这种差异与来源、制备方法等有关。


        2. pH 对 LAL 凝胶化有明显影响,应将 pH 控制在 6~8 内,最适 pH 为 7.0 土 0.2,因此,在检测药物热原时,对偏酸或犏减药物,须先调正其 pH。


        3. 孵育温度和时间。一般为 37 ℃,45~60 min,也可孵育 4~24 h,延长观察时间,可增加阳性率。


        4. 待检物的性质,如检测血液中内毒素浓度低于 10 ug/L 时,仅能在血小板部分测出。


        用本法测定时。宜用含血小板丰富的血浆。


        如用蒸镏水稀释。不仅血小板溶解放出内毒素,且能稀释血浆中的抑制因子,故可明显增强内毒素活性。为了去除血液中的抑制因子,可将稀释血浆加热后进行试猃,或用氯仿抽取等方法。

        来源:丁香实验

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