辅助方案 从纤维平板上

实验材料、试剂、仪器耗材详见「其他」。

1. 用锋利的刀片小心地切去蓝色吸头领圈的部分，细的吸口端也裁去约 3 mm。

2. 用玻璃棒将一烧结的聚乙烯片从蓝色吸头的广口端塞入，直到与吸头内部紧密接合。 用直径与聚乙烯片相同的玻璃棒有助于保持圆片的平直，即与吸头的纵轴垂直。不要将圆片塞得 过深，因为这会导致吸头胀大并破损。烧结圆片可以在吸头截面上形成一个屏障以截留从平板上 刮下的纤维素。因此，圆片必须牢固地塞在吸头中以抵抗来自真空管的吸力。

3. 测试圆片在吸头中的摆放情况：在吸头的广口端连接一段管子，管子的另一端接在真空管上。使用较强的真空并用手指堵住吸头的细口端，检査确保烧结圆片固定 不动。

4. 将 TLC 平板，纤维素面朝上，放在光盒上。将放射自显影胶片直接放在纤维素层上，仔细将平板上参照标记的位置与胶片上相应的图像位置对齐。

5. 用黑色记号笔在 TLC 平板背面（玻璃面）画出所要斑点的轮廓。

6. 拿掉胶片，将平板倒放在光盒里，用软铅笔在纤维素面描画出前面记号的轮廓以便于在不用光盒的情况下能看到斑点的轮廓。

7. 将洗脱吸头用一段管子连接到真空器上，开始抽真空。

8. 用洗脱吸头的细口从 TLC 平板上刮下标记区域的纤维素，纤维素从板上刮下后会被吸入到吸头中的滤片（烧结圆片）上。刮完后，拔下洗脱吸头广口端的管子，保持细口端朝上。

多个平板上相同的点可以用同一个吸头刮取。但是，多次重复使用后，洗脱吸头的细口端会变「钝」，越来越难从平板上刮取纤维素。此时，可以用刀片在细口端再切去一段以重新修剪出锋利 的边缘。

9. 将洗脱吸头放在一个 1.5 ml 的微量离心管中，广口端朝下，烧结圆片带有真空吸取的纤维素的一面朝上。

10. 立即加入 100 μl 电泳缓冲液，pH 1.9（洗脱缓冲液）到纤维素上，浸泡的同时从平板上真空吸取其他的斑点。

此处所用的洗脱缓冲液的 pH 应为1.9。如果 pH 1.9 的缓冲液不能洗脱下所有的磷酸肽，可以试 用去离子水。

11. 当所有的斑点都被真空吸取完并且最后吸取的斑点在缓冲液中已经浸泡了约 5 min 后，将微量离心管和吸头等都放入离心机，全速离心约 3 s，关闭离心机。再加 100 μl 洗脱缓冲液到每个管子的纤维素上，并再次浸泡 5 min，然后离心过柱。重复洗脱 5 次，最终每管有 600 μl 洗脱液，内含 > 90% 的放射活性。

12. 取出微量离心管中的洗脱吸头，小心使所有洗脱液保留在管中（有些会粘在吸头边缘形成液滴，应当将之移回管中）。保留洗脱吸头。如果洗脱了不止一个斑点，标记好哪个吸头用于哪个肽。

13. 全速离心 5 min 使洗脱液变澄清（离心后可以看见少量纤维素沉淀，沉淀多少取决于烧结圆片在洗脱吸头内的接合紧密度）。将上清液转移到新的微量离心管中。

14. 用契仑科夫计数法对洗脱液和空的洗脱吸头进行测量。

好的洗脱吸头应当保留并重复使用。清洗这些吸头时，可以使用真空器连接到吸头细口端吸出纤维素（到真空瓶中）并用约 10 ml 洗脱缓冲液或去离子水通过清洗吸头。烘干并用闪烁计数器测量后可以再次使用。

15. 在 SpeedVac 蒸发器中冻干，用契仑科夫计数法进行计数。

最终洗脱下的肽样品的 cpm 数决定其是否能用于下一步分析。

材料、试剂：

已分离过磷酸肽并经过放射自显影的 TLC 平板（见基本方案或备择方案）

电泳缓冲液，pH 1.9

仪器耗材：

单边剃刀刀片

1000 μl（蓝色）移液器吸头

小的能塞在蓝色吸头内的烧结的聚乙烯片（Kontes）

玻璃棒或类似的能将烧结圆片推入吸头的装置