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        随机序列库的纯化

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」


        1. 寡核苷酸合成完毕后,去保护,从固相支持物上切下,然后将溶液冻干(在浓缩的氢氧化铵中),或者用 10 倍体积的正丁醇于 -70℃ 放置>1h 将寡核苷酸沉淀出来。


        2. 制备一块变性的聚丙烯酰胺胶。


        3. 用 100~200 ul 的水或缓冲液(如 TE 缓冲液,pH 8.0) 重新溶解冻干的或沉淀出的寡核苷酸,加入等体积的 2×上样染料。上样前将样品加热到 75℃ 热变性 5 min。 每一 2 cm×2 cm×1.6 mm 的孔中加入约 20% 的 1 umol 合成的寡核苷酸进行电泳分离。


        4. 将胶放到塑料膜包裹的荧光薄层层析板上,在紫外灯的照射下用刀片切下寡核苷酸产物(通常为最暗的阴影条带)。


        5. 按如下步骤将寡核苷酸从胶条中洗脱出来:


        5.1 为了帮助寡核苷酸从丙烯酰胺基质中扩散出来,用力让胶条挤过小孔注射器以使之变为粉碎的颗粒。


        5.2 将碎胶放入一个能耐受极端温度的 13 ml 的离心管中。


        5.3 每 0.5 ml 的胶条(一般相当于 1~2 个加样孔的量)加入 3 ml 的 TE 缓冲液,pH 8.0,将样品于 -80℃ 放置 30 min 或直到样品冻成固体。


        5.4 将离心管放于热水浴中迅速解冻样品,然后于 90℃ 浸泡 5 min。将样品放于旋转混合器上于室温洗脱 DNA 过夜。


        6. 用 5mol/L NaCl 储液将寡核苷酸洗脱液的盐浓度调整到 0.3 mol/L, 然后加入 3 倍体积的乙醇以沉淀寡核苷酸库。于 -20℃ 放置 3 h,然后于 4℃ 以最高转速离心。冻干。用 TE 缓冲液(pH 8.0,防止核酸酶污染或 pH 的剧变)重溶合成的库。

        随机序列库的纯化
        图 1 库的设计、合成和大规模扩增的流程图

        常见问题

        1. 材料

        DNA 库


        2. 试剂

        氢氧化铵

        正丁醇

        TE 缓冲液,pH 8.0

        尿素上样缓冲液,2×

        5 mol/L NaCl

        乙醇


        3. 耗材

        荧光薄层层析板(VWR),塑料膜包裹

        紫外灯

        剃刀刀片

        小孔注射器

        能耐受极端温度的 13 ml 离心管(Sarstedt)

        90℃ 水浴

        旋转混合器

        来源:丁香实验

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