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        基本方案 用于表达监测以及与寡核苷酸芯片杂交的 mRNA 扩增

        相关实验:用于表达分析的 mRNA 的制备实验

        最新修订时间:

        原理

        扩增步骤完全决定于干净、完整的起始 RNA。对培养的细胞,作者采用胍盐裂解再用树脂纯化(如 Qiagen RNeasy Kit)的方案。 扩增 mRNA 可从 Poly(A)或总 RNA 开始。尽管 poly(A)灵敏度更高,因为除 掉了 cDNA 反应期间大部分与 rRNA 的错配,而使用总 RNA 起始则可以分析那些细 胞或组织有限的生物系统。使用总 RNA 起始一个重要的修正是将 cDNA 第一链合成的温度从 37℃ 提高到 50℃。探针选择严格限制在编码区最后的 600 个碱基;除非 3'非翻译区长度大于 800 个碱基,此时一些非翻译序列可能也被包括进来了。

        材料与仪器

        步骤

        1. 实验前准备

        1.1 材料

        样品 RNA:poly(A)或总 RNA,有义转录库对照

        1.2 试剂

        SuperScript cDNA kit (Life Techologies)

        T7T24引物

        RNA 酶抑制剂(Life Technologies 或 Ambion 公司)

        无 RNA 酶水(DEPC处理过的水,玻璃蒸馏)

        25:24:1 (V/V/V)酚:氯仿:异戊醇(分子生物学级)

        7.5 mol/L 乙酸铵 无水乙醇

        无 RNA 酶的 70% 乙醇(预冷至 -20℃)

        10×转录缓冲液(Ambion)

        10×rNTP 混合液

        100 mmol/L DTT

        10 mmol/L Bio-ll-CTP 和 Bioll-UTP (Enzo Diagnostics)

        2500 U/ul T7 RNA 聚合酶(Epicentre)

        RNeasy 小柱带RLT和RPE 缓冲液及收集管(Qiagen)

        5×片段化缓冲液

        20×SSPE (Bio-Wh1ttaker)

        0.5% (V/V) Triton X-100 (分子生物学级;Sigma)溶于无 RNA 酶水

        10 mg/ml 鲱精 DNA (Promega)

        500 pmol/L Bio948

        20×反义转录库对照

        6×SSPET: 6×SSPE 含有 0.005% (V/V) Triton X-100

        1.3 耗材

        热循环仪(例如 Perkin-Elmer 公司 9600 型 PCR 仪,带热盖)

        0.1~10 ul 带滤芯枪头(Continental)

        Lyophilizer (冻干机)

        小薄壁PCR管

        GeneChip (Affymetrix)

        1~200 ul 带滤芯凝胶上样枪头(Fisher)

        Rotisserie 式摇床(Appropriate Technical Resources)

        50℃ 加热炉


        2. 在 PCR仪上设定下列程序:

        10 min 70℃

        65 min 37℃ (用总 RNA 时 50℃)

        150 min 15.8℃

        无限 4℃ (保温)


        3. 用下列试剂为每个RNA 样品配 10 ul 第一链混合液,用带滤芯的枪头:

        4 ul 5×第一链缓冲液

        200 pmol T7T24 引物

        1 ul RNA 酶抑制剂

        1 ul 200 U/ul SuperScript Ⅱ 逆转录酶

        加无 RNA 酶的水至 10 ul


        4. 将每个RNA样品与有义转录库对照混合。每 1 ug poly(A)样品加 5 ul 对照或每 10~20 总 RNA 加 1 ml 对照。冷冻干燥至每管体积小于 10 ul, 加无 RNA 酶的水 至10 ul。同时用手预热第一链混合液。


        5. 将每份 RNA 转移到小薄壁 PCR 管中,放进 PCR 仪,启动所设程序(第一步)。


        6. 70℃ 那步完成后,在温度降到 37℃(或 50℃)2 min 的时间里,加入预热(手中)的第一链混合液(每管 10 ul)。


        7. 在合适的反应温度继续保温60 min。


        8. 每管配制 130 ul 第二链反应混合液:

        91 ul 无 RNA 酶的水

        30 ul 5×第二链缓冲液

        3 ul 10 mmol/L dNTP

        1 ul 10 U/ul E.coli 连接酶

        1 ul 2 U/ul E.coli RNA 酶 H

        4 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶

        这个混合液可以先配制,在冰上至多放置 90 min。


        9.当 PCR 仪温度降到 15.8℃ 时,每管加入 130 ul 第二链反应混合液(总共 150 ul)。用枪头反复吸放混匀,在此温度下保温>2h。


        10. 加入 2 ul 5 U/ul 的 T4 DNA 聚合酶继续保温 5 min。把样品转移到冰上。


        11. 加入 150 ul 25:24:1 的酸:氯仿:异戊醇,涡旋混匀,室温 13 000 g 离心 5 min。


        12. 小心地将水相转移到一个新的管子,不要吸到中间相。加入 70 ul 7.5 mol/L 乙酸铵和 0.5 ml 无水乙醇后混匀。室温 13 000 g 离心 20 min。


        13. 移去上清,沉淀用 0.5 ml 冷(-20℃) 70% 乙醇洗涤,涡旋混合。


        14. 室温 13 000 g 离心 10 min。移去上清,沉淀空气晾干几分钟。


        15. 用 25 无 RNA 酶的水溶解 cDNA 沉淀并定量。


        16. 每种 cDNA 样品,按下面组分配制一个反应体系:

        100 ng cDNA

        6 ul 10×转录缓冲液

        6 ul 10×rNTP混合液

        3 ul 100 mmol/L DTT

        2.4 ul 10 mmol/L Bio-ll-UTP

        2.4 ul 10 mmol/L Bio-ll-CTP

        2 ul RNA酶抑制剂

        2 ul 2500 U/ ul T7 RNA 聚合酶

        无 RNA 酶的水配平到 60 ul

        冰上可以放至多 3 h,用前升温到室温。


        17. 37℃ 保温 8 h 至过夜。纯化前可以在 -80℃ 放置至多 48 h。


        18. 加入无 RNA 酶水至 100 ul, 加入 350 ul RLT 缓冲液,混匀。加入 250 ul 无水乙醇,混匀。


        19. 将每个样品上样到一个套进收集管内的 RNeasy小柱上。台式离心机室温 8000 g 以上离心 15 s。


        20. 将柱子转到新的收集管,加入 500 RPE 缓冲液,台式离心机室温 8000 g 以上离 心 15 s。


        21. 弃去流出液,将柱子重新放入此收集管。加入 500 ul RPE 缓冲液,台式离心机以最大速度离心 2 min。


        22. 把柱子转移到一个新收集管。加入 50 ul 无 RNA 酶的水,8000 g 以上离心 1 min。 重复此步骤。合并两次洗脱液。


        23. 在 260 nm 用分光光度法测 RNA 的量。


        24. 取 10 体外转录的 RNA 用无RNA酶的水将体积配到 24 ul。加入 6 ul 5×片段化缓冲液。小心混匀,在 PCR 仪上 95℃ 温育 35 min。令其冷却到室温。-80℃ 可存放一年,用前 37℃ 融化 5 min。


        25. 按下列组分为每个反应配 170 ul 杂交反应母液:

        51 ul 20×SSPE

        1.7 ul 0.5% Triton X-100

        1.7 ul 10 mg/ml 鲱精 DNA

        20 ul 500 pmol/L Bio 948

        10 ul 20×反义转录库对照

        85.6 ul 无 RNA 酶的水


        26. 每份 30 ul 片段化的转录 RNA 加入 170 ul 杂交反应母液。在热循环仪上以 99℃ 加热 10 min, 再移到 37℃放置 5 min 以上。


        27. 微量离心机最大转速离心 5 min。


        28. 从 GeneChip 的上层隔膜插入一个带滤芯的枪头形成出气孔。从芯片的下层隔膜用带滤芯的上样枪头加入 200 ul 杂交液。拿掉出气孔,用保鲜膜覆盖上下两层。


        29. 在 rotisserie 式旋转仪上以 60 r/min 转速 40℃ 保温过夜(16~18 h)。


        30. 将芯片转入 50℃ 加热炉,继续旋转芯片整整 1 h。


        31. 从炉内拿出芯片。从上层隔膜处插入带滤芯的枪头。


        32. 微量移液器按到底,将 200 ul 上样枪头从下层隔膜间插入。垂直拿起芯片,缓慢抽出所有杂交液并放进微量离心管内保存于 -20℃。


        33. 将芯片内充满 6×SSPRET。


        34. 按厂商的说明书洗涤芯片并用藻红素染色。尽快扫描芯片。


        注意事项

        1. 许多缓冲液和酶附带在 SuperScript cDNA 试剂盒里。附带的酶量不足的话可以单独从 Life Technologies 公司定购。


        2. 所有需要控制温度的反应都在适当的热循环仪上进行。

        来源:丁香实验

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