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        用S-190抽提物进行染色质重组实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 实验前准备

        1.1 材料

        S-190 抽提物

        核心组蛋白

        1.2 试剂

        缓冲液 R

        ATP 混合物

        0.1mol/L MgCl2

        DNA模板(2.5~25 kb 环状或线性化质粒,或 λDNA)

        0.1mol/L CaCl2

        200 U/ml 微球菌核酸酶储液

        0~5 mol/L EDTA

        10 mg/ml Rnase A

        糖原终止缓冲液

        2.5 mg/ml 蛋白酶 K

        50:49:1(V/V/V)酚/氯仿/异戊醇,用 10 mmol/L Tris· Cl, pH 8.0 平衡

        2.5 mol/L 乙酸铵

        70% 和 100% 乙醇

        1.2%(m/V)琼脂糖凝胶

        TBE 缓冲液

        123 bp DNA 梯度(Life Technologies)

        1.3 仪器耗材

        27℃ 和 37℃ 水浴步骤


        2. 混合 40 ul 缓冲液R、190 抽提物及核心组蛋白。室温孵育 30 min。


        3. 加入 10 ul ATP 混合物,0.1 mol/L MgCl2 至终浓度为 7 mmol/L, 500 ng DNA 模板。27℃ 水浴 5 h。如有需要,用缓冲液 R 补齐至100 ul。


        4. 加入 3 ul 0.11 mol/L CaCl2 至组装反应体系中。将反应液等分为两份(a 和 b)。用缓冲液R按 1:50 和 1:150 稀释微球菌核酸酶(200 U/ml)。


        5. 隔一定的时间间隔(如 15 s ),在 a 管中加入 5 ul 1:150稀释液,在 b 管中加入 1 : 50 稀释液。室温消化 10 min。


        6. 加入 7 ul 0.5 mol/L EDTA 终止反应的进行。加入 1 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液, 室温孵育 10 min。


        7. 每个反应中加入 95 ul 糖原终止缓冲液,5 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液。37℃ 温育 30 min。


        8. 使用 200 ul 50:49:1 酚/氯仿/异戊醇抽提。取出 150 上层水相加入15 ul 2.5 mol/ L 乙酸铵、450 ul 100% 乙醇沉淀 DNA。室温以最大转速离心 15 min,用 200 ul 70% 乙醇洗涤沉淀。室温以最大转速离心 5 min,在空气中干燥 5 min。


        9. 用 6 ul 凝胶上样缓冲液重悬沉淀,在 1×TBE,电压约 5~10 V/cm 进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳。使用 123 bp DNA梯度作为分子质量指标。用溴化乙锭染色。

        来源:丁香实验

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