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        采用 HO 产生二倍体

        相关实验:细胞型操作实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        第1天

        把菌株9-1在YPD平板上划单克隆,于30°C下培养
        采用 HO 产生二倍体

        第3天

        上午,把菌株9-1的菌落接种到5mlYPD培养液中,于30°C下培养。将YPD平板置于4°C下储存以备第13天使用。

        第4天

        按照“技术和方案1,酵母的高效转化”将未切的质粒PCY204(来自指导老师)转化到菌株9-1。记住设置一个不含DNA的转化对照。每个转化液取20ul涂于SCura平板,在30°C下培养。不含DNA的转化对照同样操作。

        第7天

        把4个转化子在SC-ura平板上划单克隆,于30°C下培养。

        第9天

        将每个转化子的单菌落接种到5mlYPD,于30°C下培养。这将使丢失质粒的细胞得以生长.

        第10天

        使用血球计数板(附录G,用标准血球计数板进行酵母细胞计数)测定细胞密度,用无菌蒸馏水适当稀释。用每1〇〇4体积含有105?106个细胞的菌液涂5-FOA平板。

        对URA3基因进行反筛选以便使已经丢失了pCY204的细胞能够生长,将剩下的YPD培养物保存于4°C以供第12天使用。

        第12天

        将每个转化子的9个5+0八1^菌落接到YPD平板(共36个)制备一块原平板,包括亲本菌株9-1。从第10天培养的4个中间培养物中分别取34点到原平板上,在30°C下培养此YPD平板。将菌株9-2和9-3分别接到2管5mlYPD培养液中,在30°C下振荡培养。

        第13天

        用15u1菌株9-2和15u1无菌水涂SD平板,使其干燥。用菌株9-3在另一块SD平板上重复这一过程。将原平板影印到SD平板上。每一个平板都用新的绒垫以防止平板间的污染。同时将原平板影印到一个产孢平板和一个SC-ura平板上。

        第15天

        统计接合能力和在SC-um平板上的生长情况。

        第17天

        统计孢子形成能力,用牙签将细胞挑到载玻片上的水滴中,在相差显微镜下观察细胞

        来源:丁香实验

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