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    营养缺陷型、温度敏感型和渗透压敏感型突变株的分离和鉴别实验

    相关实验：营养缺陷型、温度敏感型和渗透压敏感型突变株的分离和鉴别实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    实验材料
    D665-1A）菌株（S288C
    试剂、试剂盒
    甲基磺酸乙酯硫代硫酸钠磷酸钠缓冲液
    仪器、耗材
    5-FOA平板培养管试管

    步骤

    第 1 天 接种上述菌株之一到5m l的 Y P D 中 （ 一半学生使用MATa 菌株2_1，另一半学生 使用M ATa菌 株 2-2)。在 30°C下培养过夜。 第 2 天 按 照 “技术和方案2 1， EM S诱变”中描述的方法用EM S诱变细胞。完成诱变细 胞方案后，会有一管发生突变的细胞和一管未变的对照，按照下列步骤处理这些细胞： 1 ) 在 a A A 和 5-FO A培养基上直接涂开细胞，选 择 和 突 变 体 。 2 ) 在 Y P D 上过夜培养细胞并且涂开在5-FO A 培养基上。 3 ) 稀释并在YPD 平板上涂开细胞以形成菌落，用以筛选其他突变体。 第一，直接把0.1m l诱变细胞涂布在aA A 和 5-F0 A 平板上，另外，涂布0.1m l洗 过的非诱变细胞在相同的aA A 和 5-FOA平板上，作为对照，通过诱变和非诱变培养物 所长出的菌落数可测出由EM S处理所引起的诱变频率。 第二，将每种细胞悬浮液（ 诱变和未诱变的） O .lrn l接 到 lm l的 Y P D 培养液，在 30°C下培养过夜。 第三，为了获得200个成活细胞/平板，用无菌水稀释E M S处理细胞到2000个/ ml (以血球计数器计数为基准，假 设 在 诱 变 过 程 中 不 损 失 细 胞 ）。这应该以大约 1 : 100 000倍稀释，但是或许需要根据最初使用细胞的浓度来调节稀释度。在每个YPD 平板上涂布〇.lm l， 0.2m l和 0. 4m l菌液，对这三种不同体积菌液的每一种用10块平 板。所有的平板在室温（23°C ) 下放置4 天。 第 3 天 水洗来自前一天的lml YPD 过夜培养物，悬 浮 在 lm l无菌水中，涂 布 0.1m l在相 同的5-FO A平板上，在 30°C下培养。 第 6 天 检查并且记数在YPD 平板上的菌落，并且估计EM S处理后的生存情况。选 择 10 套或更多含有大约200个菌落/平板的YPD 平板用于分 离 ① 营养缺陷型突变株②温度敏 感型突变株③渗透压敏感型突变株。用影印法把每个YPD 平板的菌落转到1 个 SD 平 板、 1 个 SC 平板、 1 个 YPD+1. 2mol/L 山梨醇平板和3 个 YPD 平板。记录被转移菌 落的编号，每个平板要编号，并且在背面做一个方向性记号。对营养缺陷型突变株的检 测 ，在 30°C下培养S C 和 SD 平 板 1 天。对温度敏感型突变株，从每组YPD 影印平板中 取一套放在37°C 2 天，另取一套在室温（23°C ) 2 天。对于渗透压敏感突变株，将一套 YPD 平板和YPD+1. 2 山梨醇平板放在30°C 2 天。 哭 变 体 5-FO A 平板在4°C放 2 天。
    第 7 天 营养缺 陷 型 突 变 株 将 10 个 SD平板中的每个与SC 平板相比较以鉴定候选的营养 缺陷型突变株。这样的菌落应该有5 % 。至少鉴定20 个候选菌落。我们使用一个多头 转 接 装 置 （ logger) 把细胞从每个菌落中转移到一系列设计好的平板上，以揭示每个 候选菌株的特定营养缺陷。多 头 转 接 （ frog) 的做法是在每个微滴盘的孔中放lOOjul无 菌水；用无菌牙签把挑选的菌落接种到每个孔里（ 注意： 所加人的各菌落应有相同的接 种量，并将其悬浮在孔里）；菌 株 2-1 或 2-2 也是同样处理；把多头转接装置的头部降 低到孔里，从每个孔里转移一滴液体，快速提起，然后放置到一块适当的新平板的表面 上。用这种多头转接法，把来自候选营养缺陷型的细胞接种至9 块库平板、 一 个 S C 平 板和一个SD 平板上。 30°C过夜培养。 突 变 体 计 数 在 第 2 天和第3 天涂在5-F0 A 板上生长起来的菌落的数量。按 下表记录资料。以 2X 108个/m l作 为 YPD 过夜培养物的饱和密度，估计菌株诱变前后 的每种突变的频率及随着诱变出现生长晕（ outgrowth) 前后的频率。从一套5-F0 A 平 板中纯化4 个菌落于另一 Y P D 上 ，用于检测它们的U ra表型。在 30°C 下培养平板。 突变型在诱变之后增加了吗？为什么诱变之后的生长可能影响每种突变型的恢复？ 第 8 天 表 2. 2 生长晕计录表 培养基处理 5-F0 A 无生长晕 生长晕 菌落数量/平板 营养缺陷型突变株记录生长情况（ 表 2.2)，给每个突变株按照它们的营养缺陷 型标记名字（ 如 leul、 len2等）。按照列出的营养缺陷型类型记录营养缺陷型的名字。 同样，在 第 7 天的SC 平板上标记相应的营养缺陷型。 分给你一个特定类型的营养缺陷 型菌株，用它进行互补实验。从你的同学那收集所有种类的营养缺陷型，把你的营养缺 陷型制备成两块Y PD 划线平板： 一个是M A Ta菌株，另一个是M A Ta菌株。每个划 线平板应该有达到1 1 条的平行连续交叉于平板表面的线（ 附录D，平板划线模板）。菌 线的顶部和底部应分别距平板的顶部和底部2cm。 30°C下培养过夜，然后放入冰箱。 渗透压敏感突变株比较生长在YPD+1. 2mol/L 山梨醇和YPD 对照平板上的菌 株。挑取大约20个能在YPD 平板上良好生长但无法在高渗平板上生长的突变体，并把 突变体通过转接装置转移到YPD 和 Y P D + L 2md/L 山梨醇平板上。菌株2-1或 2-2也 如此。平板在30°C下培养2 天。 温度敏感型突变株比较突变株在23°C和 37°C下平板的生长情况。鉴别20个以上 无法在高温下生长的菌落。用多头转接的方法从这些Ts (temperature-sensitive) -候选 菌株里转接细胞到两块YPD 平板上，菌 株 2-1或 2-2也同样处理。同样也转接在含有 3 0 % 蔗糖的YPD 平板上。这样的平板能鉴别温度敏感突变株，它的缺陷会导致在YPD 平板上的渗透裂解；或者由于高渗条件导致生长抑制（ 渗透压补救突变株)。在 37°C 下
    保温放置一块YPD 平板和YPD+ 蔗糖平板，另一块YPD 平板室温下放置2 天。 突 变 株 将 已 纯 化 的 5-?0八1?菌落划线接种到S D 和 SD+ umcil平板来测试 U ra表型。 第10天 营养缺陷型突变株按顺序复制划线平板MATa、 MATa 到绒垫上，以保证划线 是互相重叠的。复印绒垫到一个新的YPD 平板上， 30°C培养。 渗透压敏感突变株记录生长情况并给每个突变体编一个号。用 1 0 个突变体制备 两块完全相同的划线YPD 母 板 （ 加上菌株2-1或 2-2对照）。 30°C过夜。 温度敏感型突变株分别记录突变体在23°C 和 37°C 的生长情况。给每个突变体作 一个编号。在一对YPD 平板上，将突变体制备两块完全相同的划线母板（ 加上菌株2- 1 或 2-2 对照）。室温下2 天。 Mm3 突 变 株 从 第 9 天 开 始 记 录 突 变 株 的 生 长 情 况 。 第 1 1 天 营养缺陷型突变株复制平板上的交叉划线的突变体到一块S C 和 S D 平板上。 30°C培养。 渗透压敏感突变株把一块划线平板调换成相反交配型的渗透压敏感突变株的划线 平板。用复制板制备一个交叉划线YPD 平板。 30°C培养过夜。 第 1 2 天 营养缺陷型突变株记录互补检测。有多少不互补的情况被观察到？搜索酵母基因 组数据库(http://pathway,yeastgenome.org/biocyc/)，估计正在研究的材料中产生营 养缺陷表型突变体的基因数量。 渗透压敏感突变株复制交叉划线突变体到一块YPD 和 YPD+ 山梨醇平板上，并 且将所有的平板放在30°C 2 天。如果在不同座位突变的两个隐性OsmT菌株接合，预 期二倍体有正常的渗透压敏感性。 温度敏感型突变株把你的一块划线平板换成相反交配型的T f 突变株划线平板。 用复制板制备一个交叉划线YPD 平板。 23°C 2 天。 第 1 4 天 温度敏感型突变株复制交叉划线突变株到2 块 YPD 平板上；一块板于37°C 2 天 ，另一块于23°C 2 天。 渗透压敏感突变株记录互补检测。得到了多少互补组，并且思考为什么互补组会 非常少？ 第 1 6 天 温度敏感型突变株记录互补检测

    来源：丁香实验

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