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        将 siRNA 微注射入哺乳动物细胞

        相关实验:通过微注射操作哺乳动物细胞的基因实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        将 siRNA 微注射入哺乳动物细胞

        材料

        试剂

        注射的细胞系(如在这使用的黏附细胞系)

        荧光标记的葡聚糖(分子探针/In vitrogen )

        我们推荐使用经氨基化学修饰后的葡聚糖,氨基使葡聚糖可以通过乙醛进行固定。同时也推荐使用分子质量在 TOkDa 左右的葡聚糖来避免其穿过核膜。

        寡 聚 核 苷 酸 siR N A

        利用供应商提供的网上软件可以设计目的基因的 siRNA 和 对 照 s; r n a 。将寡聚核苷酸复性后制备成 20umol/L 的储存液,一 20℃ 储 存 。

        siRNA 样 品 缓 冲 液

        5 mmol/L 憐 酸 納(p H 7. 2)

        100 mmol/L K C l

        仪器

        盖 玻 片(酸洗)

        分析大多数实验结果的落射荧光显微镜

        配备多个物镜的高质量倒置光学显微镜

        半自动的微注射系统,包括注射电压、时间以及显微操作器和操作杆都可以调控。

        微注射设备可以从多个生产厂家获得,并 已 经 在 其 他 地 方 详 细 描 述(R oseet al.1999; 见Ikeda2004 的详细描述; King 2004)。微注射针可以购买得到;我们已经成功制造了我们自己的商业化注射针拆卸工具。

        方法

        1.制备 s i R N A 寡聚核苷酸(特异和对照的寡聚核苷酸)的工作液, s i R N A 寡聚核苷酸在 s i R N A 样品缓冲液中的浓度为 50n m o l/L 。在 s i R N A 样品缓冲液中以 5m g /m l 溶解荧光标记的葡聚糖。

        2 . 制备微注射的 s i R N A ,将 s i R N A 寡聚核苷酸的工作液 1 0 倍稀释成标记的葡聚糖溶液。

        该皮摩尔浓度有效,并且足以避免出现脱靶的非特异效应。

        3 . 将黏附细胞铺在酸洗的盖玻片上,长至合适的密度,约 5 0 % 汇合。
        在该点,如果需要使细胞静止,可以去除血清。

        4 . 按标准程序,利用制备的特异或对照 s i R N A 样 品 进 行 核 的 显 微 注 射(如 见 King2004 和图 1)。

        也可以使用适合研究系统的 DNA、肽以及其他活质分子(Z huetaL 2006)。

        5.微注射后,将细胞孵育一段时间使靶蛋白足以敲除。
        该 siRN A 效应快速并具有特异性。在多数情况下,靶 inRNA 在 注 射 后 6 h 内 用 RT-PC R 无法检测到变化。该过程的时间段随靶蛋白的半衰期而变化,但大多数调节蛋白的半衰期相对较短。

        6 . 分析适用于研究系统的细胞。

        该方法的一个重要方面是用于评价微注射的分析方法。 siR N A 产生的表型必须利用一个客观的指标进行标定,尤其是一个能够将毎个注射的单细胞以阳性或阴性进行划分的指标。好 的 样 品 可 以 利 用 溴 脱 氧 尿 苷 掺 人(L ie t al.2002)、适 当 标 记 物 的免疫细胞化学染色(Klappacher etal.200 2 ) 或者利用共注射的启动子/报 道 基 因 构 建 产 物(p erissie ta l.2004;Zhu et al.2006)

        来源:丁香实验

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