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用母体血进行染色体异常的产前诊断实验

相关实验：用母体血进行染色体异常的产前诊断实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	Ficoll 淋巴细胞分离液 CD3、CD13 抗体均用生物素标记
试剂、试剂盒	PBS 溶液 FBS溶液台盼蓝溶液乙醇溶液多聚甲醛 FITC 标记的 CD71 膜抗体 carnoy 固定液 . 量化链霉亲和素磁化稀土
仪器、耗材	氩离子激光流式细胞仪直标探针

步骤

3.1 血细胞分离 1 . 抽取约 30m L 静脉血置于肝素钠抗凝采血管中（见注解 2)。 2 . 吸取 15m L 血样加到50m L 聚酯锥形管中，并加 15mLPBSE (血和 PBS E 的终体积比为1 : 1)。 30m L 血样分到2 个 50m L 聚酯锥形管中。 3 . 用消毒的注射器和巴氏吸管将1〇〜15m L 淋巴细胞分离液加于上述混合液管底，抒紧管盖， 1600r/min (200g ) 离心 25min。 4 . 小心地将管取出，用真空泵和巴氏吸管吸掉上层（主要成分为血浆和血小板）弃去，留下此层约1cm。 5 . 用 IOmL移液管吸取上面两管的单核细胞层，混合于 50m L 管内， 1600 r/m in (200g〇离心 lOmin。 6 . 倒掉上清，用 50m L 的 PBSE重悬细胞沉淀， 1200r/min (IOOg) 离心 5min。倒掉上清，用与最初血样等体积的PBSE (30mL，见注解 3 ) 重悬细胞沉淀，涡旋振荡器上振荡以获得均一的细胞悬液。 7 . 取 5(^L 细胞悬液分装到5m L 聚酯管中，每管加 50juL的 0. 2 % 台盼蓝后，将细胞置于血球计数板上计数，用 PBSE/ 2 % FBS悬浮细胞至终浓度 20X

3 . 2 定量磁力微粒去除 1 . 将 CD3-生物素和 ⑶ 13-生物素按IO6 个细胞中加 I iUg的浓度混合进行细胞染色。置冰上孵育20min。 2 . 用 PBSE洗细胞悬液 2 次，在 15m L 聚酯管中用 PBSE/ 5 % FBS重悬细胞，使细胞终浓度为IOXlO6 个/mL。 3 . 加适量洗过的抗生物素磁力微粒（量的计算见本章2. 1.2)，置冰上孵育 15〜20min，每隔 5m in进行旋转确保微粒和细胞的悬液均一。 4 . 将管置于磁场中 5min，用电动吸管小心移去未结合的细胞，置于新的 15m L 聚酯管内。再次进行磁场分离以确保去除所有磁性微粒，将未结合的细胞转移到第三个干净的15m L 聚酯管内。 5 . 离心未结合的细胞，用 10〜20m L 的 PBSE重悬，如上述 3 . 1 中第7 步的方法计数去除后细胞。用 PBSE/2% FBS液重悬细胞，使细胞终浓度为 20X 106 个/mL〇 IO6 个 /m L 0 3 . 3 细胞表面染色 1 . 在每 IX lO 6 细胞中加 1啤的 CD71-FITC (为厂家推荐量一半）和 IOjtxL 的 CD45-P E 稀释液（见本章 2. 1. 3)，置冰上孵育20min。 2 . 用 PBSE/2%FBS液洗细胞后，用 3 % 多聚甲醛重悬细胞至终浓度为IOX IO6 个/mL，置冰上孵育60 min。 3 . 用 PBSE/ 2 % FBS液洗细胞2 次，然后用 PBSE/ 2 % FBS液重悬细胞至终浓度 IOXlO6 个/mL。 4. 4°C避光保存，以备分选。 3 . 4 流式细胞分选 1 . 调整氩激光到波长488nm，在 50m W 水平操作。 2 . 颜色补偿： 2 5 % 〜3 0 % FTTC信号源于 P E 信号， 5 % P E 信号来源于 FITC 信号，通过相应的单色或双色荧光染料染色的样品调试得到。 3 . 液滴振动频率提升到30k H z 以生成更多更小的液滴，鞘液压力为 12psi (lpsi=6. 894 76XIO3Pa)0 4 . 采用双液滴偏离和非同步性进行分选。根据分离和去除后的细胞浓度，用 0. 2〜2mL PBS/ 2 % FBS悬浮样本，使得流动速度为1000〜6000个/s。

5 . 前向角光散射作为直线信号被收集，所有的发射荧光用四级十进对数标尺进行收集。设置光散射门以消除碎片和聚集。靶细胞为CD45-和 CD71+。 3 . 5 细胞收集将一个甲硅烷基化的载玻片置于分选细胞束通路上，以收集需要的细胞。然后使载玻片在空气中完全晾干。干燥的载玻片标本于新鲜的C am oy固定液中固定 2 次，每次 15 min，使细胞黏附在载玻片上的同时可以去除残留的流式分选 Isoton I I 液。玻片晾干后一20°C保存以备FISH 操作。同样，也可用一无菌的小离心管代替载玻片收集悬液中的细胞。用 PBSE/2%FBS液洗脱分选的细胞^ 以去除残留的盐，然后制成 20〜50p L 的细胞悬液， 4°C保存以备 F IS H 操作使用 (见注解 4)。 3. 6 五色 FISH 1 . 将标本于室温的2X SSC 中放置5min。 2 . 将标本在 7 0 % 、 9 0 % 、 1 0 0 % 的系列乙醇中各 2m in使细胞 D N A 脱水，空气中完全晾干。 3 . 将标本置于7 0 % 甲酰胺/2X SSC 中 20m in 以变性细胞DNA。该变性时间的确定基于3 % 多聚甲醛的固定。如果甲醛浓度低于3 % ，变性时间应相应减少 5〜lOmin。还应注意：一次变性的标本多于一张，每增加一张标本，变性液的温度将被降低T C ，因此应将水浴温度相应提高。 4 . 在 20m in变性的问时，开始准备五色探针混合液，并在冰上避光保存备用。 5 . 迅速将变性好的标本置于7 0 % 、 9 0 % 和 1 0 0 % 乙醇（均为一20°C ) 中脱水各 2 min，空气中完全晾干。 6 . 将 5 个探针混合液在70°C水浴中变性5min。 7 . 将变性好的探针混合液迅速加于玻片上的目标杂交区，盖上 22mmX 22m m 盖片，并用橡皮泥封片。 8 . 将标本置于37°C湿盒中杂交过S (16h)。 9 . 次日早晨，将装在有盖染色缸中的约 40m L 的 2 X SSC在水浴中预热至 70V 。 10. 每次只处理一张标本，去掉盖片和橡皮泥，然后在 70°C 的 2 X S S C 中洗 l 〇 s 。 11. 立即转入IX P B D 内 lm in。 12•在24m m X 50m m 盖片上加18julDAPI-I I 复染液，用纸巾吸去标本表面

多余的PBD后将其倒扣于加D A PI的盖片上。轻压排除气泡，将标本置于避光玻片盒内，避免过多暴露于光线中。 13.待 D A PI复染细胞IOmiri后即可在荧光显微镜下观察。分析完毕后，标本置片盒内4°C保存。 3. 7 镜检分析 1 . 通过探针标记的特异颜色识别每条待检的染色体，对每个细胞进行分析每种探针显示的〇、 1、 2、 3 或更多信号。尽管我们曾随意选择每一杂交反应 3000个核进行分析，事实上经过流式细胞分选后每一样本平均仅能获得约1500 个核供 FISH 分析（见注解 5)。， 2 . 男胎细胞可通过一个X 信号（黄色）和一个 Y 信号（蓝色）进行识别 (见注解 5)。 3 . 计数 3 种直接信号可检测胎儿13、 18、 2 1 三体。判断结果时， 3 种信号计数必须注意区分信号和信号分离的情况。由于间期核不同阶段，染色体的浓缩程度不同，大部分 FISH 探针都是由好几个DNA 片段组成。信号分离可能出现在一条或是两条同源染色体上。一般认为判断为信号分离的标准有两个：①两个信号的大小和亮度都小于另一同源染色体的信号；②两信号间的距离比两个信号的直径小（见注解 6)。 3. 8 MACS 细胞的 FISH 对用 MACS方法从母亲血中富集的细胞进行F IS H 的操作程序有一些改动 (见注解 7)。 4 . 注释 1 . 用多种探针检测非整倍体时，用荧光素检测的抗体可能会影响F IS H 分析。用 FITC 标记的抗体染色细胞内含量丰富的蛋白质（如 7-珠蛋白）会导致整个细胞核都被荧光覆盖。用发射绿色光谱范围的荧光素标记的探针很难识别，限制了用于F IS H 分析的染色体特异性探针的数量。因此，非常重要的是：在做 FISH 之前应了解FACS富集细胞过程中使用了哪些荧光染料。 2 . 富集前血液标本的保存温度控制对保持良好的标本质量，这对随后的细胞分离和FISH 都很重要。若隔夜保存，标本可放室温。过高或过低的温度条件会引起细胞成团或细胞溶解，导致收集细胞失败。在每年夏季的几个月中运送细胞有必要用冰袋。

3 . 不管用什么类型试剂、什么浓度分离细胞，尽量将获得的细胞层洗干净很重要，避免细胞质残留或核聚集成团以影响FISH 分析。 4 . 在细胞质中有似是而非的颗粒，使得细胞核看上去被薄雾状物覆盖。探针几乎杂交不上。由于传统的细胞遗传分析实验，细胞的洗脱不彻底、没在严格的温度和湿度条件下进行细胞干燥。为避免这种情况，细胞直接分选到硅化玻片上后，在 37°C恒温板上放 30〜60m in 瞭干，然后用 Carnoy液固定。用 Carnoy 液固定后，同样要注意温度和湿度问题。当湿度较低或暖气房间（如冬季），同样可能会出现细胞质颗粒样背景问题。为避免这个问题，可在 Camoy液固定后，将玻片水平或垂直放在小盒子里维持湿度，缓慢晾干。或者，（用 FACS或 MACS) 收集到的细胞滴片前可以先放到塑料管内洗脱。为防止细胞损失，不进行细胞离心，重悬在小于1〇〇〜2〇〇juL的体积中再进行滴片。 5 . 胎儿细胞富集方法大约能将收集胎儿细胞的效率提高100倍，所以大概能在每 1000个母血细胞中收集到1 个胎儿细胞，而这之前是平均IO5 个母血细胞中能收集到1 个胎儿细胞。根据采用的细胞分离和富集方法，收集和扫描的细胞总数都将发生改变。我们的研究小组每个标本可分析到3000个核。如果在分析 3000个细胞核后仍没发现1 个胎儿细胞，我们发现分析更多的细胞也不太有发现胎儿细胞的可能。 6 . 在分析的同时，每位观察者应将每个核的判断记录在表格中。如在临床细胞遗传学分析一样，在玻片上按从左到右、从上到下的方式进行系统的细胞分析。熟练的观察者能在2〜3h 内在一张用三种探针杂交的玻片上分析3000个核，在用 5 种探针杂交的玻片上记数同样的细胞核数则需3〜5h 。在传统的细胞遗传学产前诊断中，确诊胎儿非整倍体需要发现多个克隆。但如果是用胎儿细胞分析，只要在收集到的胎儿细胞中发现一个三倍体细胞，结果与胎儿核型结果一致就能确诊。当然，前提是在杂交效率理想的条件下，所有或大部分细胞核都有信号。 7 . 对 MACS收集到的细胞若不用多聚甲醛固定或用1 % 〜2 % 的低浓度固定， FISH 较容易成功。 MACS收集到的细胞应在相差显微镜下评估。如果细胞核灰色而扁平，用 80°C烤炉（非甲酰胺）变性 1〜3m in 即可。若用多聚甲醛固定，变性时间应相应延长。如果杂交无信号或信号弱，则需要用蛋白酶K 或胃蛋白酶进行前处理。

来源：丁香实验

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