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        CDP 用于体外转染

        相关实验:用于核酸传递的含环糊精的聚阳离子

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        CDP 用于体外转染

        材料

        试剂

        完 全 培 养 基(含 抗 生 素 和 血 清),针 对 细 胞 类 型 进 行 合 理 选 择含 有 环 糊 精 的 聚 阳 离 子(C D P ; 20m g /m l )

        冻干后的固体溶于不含 DNase 和 RNase 的水中。储液为无色。

        核 酸(80umol/L)

        D N A z y m e (Eurogentec)

        质 粒 D N A (p D N A )

        小 干 扰 R N A (s i R N A ) (D h a r m a c o n , Integrated D N A Technologies)

        用细菌 DH5 〇 t (Invitrogen) 扩增 pDNA, 纯化使用 Novagen’s UltraMobius 1000 试剂盒。

        DNAzyme 和 siRNA 为化学合成,经 高 效 液 相 色 谱(HPLC) 纯化,并用凝胶电泳验证。

        核酸用不含 DNase 和 RNase 的水,或者不含 RNase 的乙酸钾缓冲液溶解。

        O p t i - M E M I 低 血 清 培 养 基(Invitrogen)

        磷 酸 盐 缓 冲 液(P B S ,灭 菌)

        胰 酶

        仪器

        细 胞 培 养 板(6 孔 或 2 4 孔)

        细 胞 培 养 箱(37°C , 5 % C O 2)

        方 法

        1.转染前一天,胰酶消化并收获指数增长期的贴壁细胞。将细胞接种到6 孔 或 24孔板中,细胞密度24孔板中为每孔5X 104 个细胞, 6 孔板中为每孔2. 5X 105个细胞。

        2•每孔加入I m l (24孔板)或 5m l ( 6 孔板)的完全培养基,在细胞培养箱中37°C ,5 % C O 2 下培养24 h 。

        3.配制复合物溶液:将 1 倍体积的C D P 储 存 液(典型的 IOm I每孔)加人到等体积的核酸储存液中。

        对于体外转染,核酸浓度如高于0.2 mg/ml,会导致核酸不能被等体积的CDP溶液完全结合 。这种情况下混合液通常为不透明或乳状,而且基因表达或基因敲除效果差。

        4.在每体积复合物溶液中加入9 体 积 的 O p t i - M E M (24孔板中每孔加人180ul OptiM E M )。

        5.从孔中吸出完全生长培养基。用 0.5m l P B S 洗涤细胞。

        6•每孔加人200ul(24 孔板)或 1000ul (6孔板)的复合物/Opti-M E M 的混合液。将培养板放回培养箱中培养4 h 。

        7.从孔中吸除复合物/Opti-M E M 的混合液。加 人 I m l (24孔板)或 5m l (6孔板)的完全培养基。

        8.在适当的时间,进行基因表达或基因敲除的检测。

        用 C D P 进行体内转染

        材料

        试剂

        金 刚 焼 -PEI (50m g/m l)

        A I > P E G ,乳 糖 封 端(A I > P E O L a c )

        AI> P E G , 不 含 配 体(A I > P E G )

        AI> P E G ,偶 联 转 铁 蛋 白(A E H P E O T f )

        冻干后的固体溶于不含 D N a s e 和 R N a s e 的水中。储 液 为 无 色(A E H P E G 和 A I > P E O L a c )或红色/橙 红(A D ^ P E O T f )

        含 有 环 糊 精 的 聚 阳 离 子(CDP, 20m g/m l)

        冻干后的固体溶于不含 D N a s e 和 R N a s e 的水中。储液为无色。

        D-葡 萄 糖(1 0% m /V ,溶于水中 [D 10 W )

        将葡萄糖溶于不含DNase 和 RNase 的水中, 0.2um 的微孔滤膜过滤。所有体内实验中,注射液葡萄糖溶液终浓度均为 5% 。

        小 鼠(20 g )

        核 酸(80umol/L )

        D N A z y m e (Eurogentec)

        质 粒 D N A (p D N A )

        小 干 扰 R N A (s i R N A ) (D h a r m a c o n , IntegratedDNATechnologies)

        用细菌 DH5<x (Invitrogen) 扩增 pDNA, 纯化使用 Novagen’s UltraMobius 1000 试剂盒。

        DNAzyme 和 siRNA 为化学合成,经 高 效 液 相 色 谱(HPLC) 纯化,并用凝胶电泳验证。

        核酸用不含DNase 和 RNase 的水,或者不含 RNase 的乙酸钾缓冲液溶解。

        仪器

        27 号针头

        I m l 注射器

        方 法

        1•将 CDP、 AEKPEG 和 AD——P E O 配体在水中混合,最 终 AD : (3-C D 的摩尔比为 I : 1。

        2 . 将上述溶液(约 5CVg/20 g 小鼠)加人到等体积的核酸溶液中。

        3 . 加入一体积(约 lOOpg^Og 小鼠)无菌 DwW 到等体积的上述复合物溶液中。

        4 . 用带有 27 号针头的Im I 注射器吸取上述复合物溶液。

        5.将小鼠的尾静脉预热。

        6•在 2〜3s 内将复合物溶液注射到尾静脉中。

        来源:丁香实验

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