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        子宫内小鼠胚胎的电穿孔

        相关实验：用于小鼠胚胎内高效基因转递的子宫内微电穿孔技术

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        子宫内小鼠胚胎的电穿孔

        材料

        试剂
        待 导 入 的 D N A , 溶 液（l ug /ul)

        乙 醇（5 0 % )

        固绿 F C F 蛋白质染色试剂（Sigm a-A ld rich )

        磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

        怀 孕 小 鼠（E 10. 5 或 者 怀 孕 期 更 长）

        戊巴比妥钠

        仪器

        不锈钢制小手术夹
        电 极 将装在塑料管中连接有金属针（W P I 5428)上 的 钨 丝 和 铂 丝 （A -M 系统）用 砂 纸 磨 尖 （图 1B ) 制备电极。电极用一薄层绝缘漆抛光，待抛光漆干了以后，用丙酮浸泡的棉花刷将金 属 针 从 尖 端 （约 200Mm ) 移去。 光 纤 光 源 （Leica) 手 术 镊 （R O B O Z ) 玻 璃 毛 细 管 （Stoelting公 司 ） 拉长并用镊子固定尖端（图 1A )。 微 操 作 器 （micromanipulator) ( K D scientific) 微 吸 液 器 （micropipette) 脉 冲 发 生 器 （M o d e l 2100, A -M 系 统 ） 手 术 剪 （R O B O Z ) 缝 合 线 （3-0， D e x o n I I ) 图 I. A •用于注射的玻璃毛细管的形状，通过微量吸液管拉长而成，尖端外径约为2C V m 。为防止伤 害子宫，离 尖 端 1_处 的 外 径 应 不 超 过 5 0 ^ 。 R 钨丝和铂丝用砂纸磨尖，并用一薄层绝缘漆抛光。 方法 1 . 腹腔内注射戊巴比妥钠（50fxg/g 体重）麻 醉 孕 鼠 （E 1 0 . 5 或孕期更长）。 5 〜 IOmin 后 ，用剃须刀的刀刃刮去小鼠腹部的毛，并 用 5 0 % 乙醇洗涤。 2 . 在腹腔剪一个2. 5c m 或更短的小口，用镊子小心取出子宫角，把其放在P B S 浸润的 棉纱上， 然后把它们放在伤口周 围 。 用 P B S 维持子宫的湿度很重要。 3. 用光纤光观察胚胎。用 温 热 的 P B S (37°C ) 浸湿光纤末端和子宫角。用食指和 中指固定住光纤，将子宫放在拇指和光纤之伺。轻轻挤压子宫，使胚胎靠近子 宫 壁 （图 2)。 用 P B S 浸润的棉花刷摩擦子宫表面可将胚胎转到位。 4•用浓度为l%的固绿蛋白质染液配制 l(! x l D N A (lM g/fxl) 5 . 胚胎到位以后，用微操作器将D N A -固绿染料混合液注入侧脑室内。 6•将钨阴极和钴阳极插入到子宫中，使祀区域在两个电极之间（图 2)。在 I s 间隔内连 续用脉冲发射器施加三方波电流脉冲（7〜10V ， 100 m s ) 3 次。 注意手术时间越短，存活率越高。每只孕鼠最长手术时间为30min。
        图 2. A . 在食指和中指间固定光纤。 B. 将子宫角放在光源和拇指之间。按压子宫使胚胎到达靠 近膜的位置。 C . 注 射 l/xl D N A 溶液到脑室。 D . 将钨负电极和铂正电极分别插人到左右两个半 球 ，然后输人一系列三方波电流脉冲。 E •不同电穿孔中两个电极的位置。 7.将子宫角放回原处，加人少量P BS (约5(%1)。缝合子宫壁上的手术切口，并 用 9m m 的小手术夹闭合皮肤。在小鼠从麻醉作用中清醒之前（约 2h ) 保持小鼠的温度。 胚胎的存活率以及细胞转染效率依胚胎和电穿孔位置不同而各异。在 E 11.5 进行电穿孔， 有 6 0 % 的胚胎存活，存活的胚胎中5 0 % 显示出电穿孔成功。依赖于胚胎所处发育阶段，以 及电穿孔的区域对实验条件优化十分必要。

         

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        来源：丁香实验

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