重组杆状病毒转导脊椎动物细胞

重组杆状病毒转导脊椎动物细胞

材料

杆 状 病 毒（浓 缩 的 高 滴 度 的 储 备 病 毒）

细 胞（如 人 肝 细 胞 系 ；H e p G 2 > ， 指 数 生 长 期 细 胞
细 胞 培 养 液（完 全 捧 养 液 ，无 血 清 培 养 液 和 选 择 培 养 液 )

D ulb ecco 磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

2.7m m o l/L K C l

I. 5m m o l/L K H 2PO 4

13 6 . 9m m ol/L N aC l

8.9m m ol/L N a2 H P O 4 • 7 H 20

丁 酸 纳（lm o l/ L ，溶 于 P B S ) (Sigm a-A ld rich )

0.2 p m 滤 器 过 滤 除 菌

膜 蛋 白 酶 -E D T A (C am brex)

仪器

. 细 胞 培 养 管

离 心 管（15 m l)

移 液 管（IOml)

组 织 培 养 板（6 孔 板）

方法

这个方法是基于 6 孔板培养的细胞上设计的，如果使用的是与 6 孔板直径不同的多孔板或培养皿，需要相应地调整细胞的密度和试剂的体积。

收取处于指数生长期的细胞

1•除去细胞培养液，用 5〜I O m l 无菌的 P B S 润洗细胞一次。

2•用胰蛋白酶—— E D T A 消化细胞，每 90 mm 培养皿大约用 lm l。

3•将细胞悬液移到一个装有 4 ml 新鲜培养液的 15 ml 离心管子中，室 温 47〜92 g 离心5〜 7 min0

4•除去培养液，用 1〜4m l 新鲜培养液重悬细胞沉淀。

5 . 用血球计数板确定细胞密度，将细胞稀释到 I X l O ⁵〜2 X 1 0⁵ 后接种于 6 孔板中。

6•每孔加人 3m l 培养液，将细胞置于加湿的培养箱中培养 18〜20 h ， 5 % C 0 2, 37°C 。

准确的细胞密度由细胞的大小和生长率决定，并且需要通过实验来确定。细胞在转导时达到 5 0 % 〜7 〇% 的汇合度可以获得好的转导效率。

转导

7•用预热的含有病毒的无血清培养液替换原先的培养液，将细胞和病毒在加湿的培养箱中孵育 2 h ， 5 % C 0 2。温和的操作杆状病毒。. 病毒不能经受剧烈涡旋或反复吹打。

8 . 吸去含有病毒的培养液，每孔中加人 3m l 预热的含血清的培养液。继续培养细胞。

9.转导后 24〜72 h ，检查细胞