重组展示病毒的免疫电镜分析

重组展示病毒的免疫电镜分析

材料

试剂

抗体

针对目的蛋白质或多肽的一抗

二 抗（可选）

杆 状 病 毒（蔵糖梯度纯化 ；S u m m e r s and Smith I9S7; King and Possee I” 2;O ^eillyetaL 1994)

去离子蒸馏

使用前〇 • 22um 滤器过滤除菌。

1 0 % 胎 牛 血 清（F B S ) 稀释于 P B S 溶液

使用前 0 • 22um 滤器过滤除菌。

固定剂（可选)： 1 % 戊 二 醛 多 聚 甲 醛 的 P B S 溶液或 2.5% 戊二酸的 P B S 溶液

使用前用〇.22um 滤器除菌。

0.15 % 甘氨酸的 P B S 溶液

使用前用〇 • 22um 滤器除菌。

甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液

在 20 ml 沸腾的双蒸水中加人 0. 3 g 的甲基纤维素，冰浴搅拌 4 —— 8 h , 然后加入 80m g 乙酸双氧铀， 4°C 放置至少 M h, 4°C 保存备用。

磷酸盐缓冲液（P B S , p H 7. 4〜7. 5)

使用前用〇.22fxm 滤器除菌，4°C 保存。

蛋白-A -结合的纳米金颗粒（直 径 5〜I O n m )。

仪器

包被了碳和 F o r m v a r 树脂的金属格栅’

滤纸

滤 器（0.22um )

封 口 膜（Parafilm)

注射器

i. 用 P B S 将病毒稀释到合适的浓度。

a. 确定格栅上病毒的最适密度，用 P B S 5 倍 或 1 0 倍 梯 度（如未稀释、 10^-1、1 〇^-2、10^-3) 稀释病毒。

可选步骤，用 0.22um滤器过滤稀释的样品，让聚集病毒颗粒充分散 开 。

b•等分稀释好的样品，各 10pJ 加到每个格栅上，使病毒颗粒与之接触。

c. 用步骤 1 0 的方法进行对比和包埋。可以风干。

d. 电子显微镜观察格栅。

2•取 1 0 0 最适稀释倍数的病毒（由步骤工确定的）到格栅上，室温放置 1 〇〜60 min。最后格栅上病毒的密度取决于孵育的时间。
作为可供选择的步骤，样品可以和固定剂混合，或者是在步骤 8 以后固定。

3.室温下， I O m i n 内用〇 • 1 5 % 甘氨酸洗涤格栅 4 次。

4.用 10% F B S 封闭非特异性结合位点，室温， lOmin。用滤纸吸走多余液体。

5•加入 10% F B S 稀释的一抗，室温孵育 15〜60m i n 。每块格栅需要 5〜l 〇ul。

6.室温下， 15m i n 内用 10% F B S 或 0 •1 5 % 甘氨酸洗涤 5 次。用滤纸吸走残余液体。作为可供选择的步骤，室温下用稀释于 1 0 % 胎牛血清的桥接抗体孵育 15〜60 min。按步骤7 的描述洗涤。这种方法只有当一抗和蛋白 A 的结合能力很弱（如绵羊和山羊 IgG 和一些单克隆抗体）或为增强所需的金的信号时才使用。

7.加 人 10% F B S 稀释的蛋白-A -结合纳米金颗粒，室温孵育 30〜60m i n 。每块格栅需要 5〜10ul。

8.室温下， 20rain 内用 1 0% F B S 或 0 •1 5 % 甘氨酸洗涤 8 次。

9•室温下， 8m i n 内用双蒸水洗淥 4 次。

作为可供选择的步骤，室温下用甲基纤维素/乙酸双氧铀负染色格栅 30s, 并使之风干。

10.冰上用预冷的甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液孵育样品，每 I O s 换一次液，换 2 次液。

11.将格栅转移到甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液的第三个液滴上，冰上孵育 lOmin。

12.从液滴上将格栅取出，用滤纸吸去甲基纤维素/乙酸双氧铀溶液使之变薄成膜，风干 I O m i n 以上。

13.用透射式电子显微镜观察纳米金颗粒的分布情况，从而获得病毒颗粒的数据。