基本方案1 用于表达监测的 mRNA 的扩增及其与寡核苷酸分析芯片的杂交

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	样品 RNA
试剂、试剂盒	乙醇 10 X rNTP 混合液 T7 RNA 聚合酶 12 X MES 缓冲液 EDTA 乙酸铵鲑鱼精 DNA RNeasy 微柱及 RCT 和 RPE 缓冲液和收集管 Superscript cDNA kit (Life Technologies)酚氯仿异戊醇 RNA 酶抑制剂制备对照转录池 10 X 转录缓冲液牛血清白蛋白 5 X 片段缓冲液
仪器、耗材	薄壁小 PCR 管基因芯片漩涡混合器上样 Tip 头烤箱冻干机 Tip 头

步骤

1. 如下在热循环仪上设置链接程序： IOmin 70°C 65min 37°C (或 50°C用于总 R N A ) 150min 15.8°C 00 4 °C 0 2 . 如下用〇.I 〜IOjul T ip 头为样品RN A 配备 IOjuI第一链反应混合物： 4/xl5X 第一链缓冲液； 200pmol T7T24 ：引物； Im I R N A 酶抑制剂； IjlJ 200U/jul Superscript n 反转录酶； D E P C 处理的H 2O 加至总体积为104。 3. 将每种样品R N A 与制备的对照转录池混合。每 ljug poly A+ RN A 样品加入制备的对照池，或者每 10〜 20吨总 R N A 加入 Ijul对照池。冻干至每管体积< 1 〇 4 , 但不要完全冻干。 DEPC处理的H2O 加至总体积为IOjliU 同时，用手预热第一链反应混合物。 4•将各种R N A 样品转移至薄壁小P C R 管，置于热循环仪中。开始设置好的链接程序。在第一步7〇° C 完成后，等 2min使 P C R 管内溶液降至37°C (或 50。〇，加入预热的

$第一链反应混合物（ IOpJ/管）保持适宜的反应温度60m m 。 5. 准备第二链反应混合物1304/管（预先配制，置冰上< 9 0 min): 914 DEPC 处理的 H 2O ; 3(^15 X 第二链缓冲液； 3/al 10mmol/L d N T P ； Ipl 10U /julK« ^ 连接酶； Ipl 2U / V 1£： .coZi R N A 酶 H ; 4jul lOU/jul D N A 聚合酶。 6. 在热循环仪反应至15. 8°C 后，每管加入13〇 W 的第二链反应混合物（至总体积 150jul)，用移液器轻轻吹打混匀。 15.8°C 孵育> 2 h。加入 5U /julT4 D N A 聚合酶 2jul，继续孵育5min。将样品置于冰上。 7. 加入 25:24 :1酚/氯仿/异戊醇15如1，振荡混匀，室温13 00(^离心5111丨11。上层水相转移至新P C R 管，注意避免中间界面的污染。 8. 加入 7. 5mol/L 乙酸铵70/^1和乙醇0. 5m l ，混勻。室温 13 OOOg•离心20min。去上清。用 0. 5m l 冰冷的7 0 % 乙醇洗沉淀。振荡混匀。室温13 O O O g离心lOmin，去上清液，空气干燥几分钟。 25julD E P C 处理的H 2O 重悬c D N A 沉淀，定量 cDN A (支持方案2)。 9. 为每个c D N A 样品配制如下反应混合液（或预先配制除样品c D N A 以外的其余成分，置冰上< 3 h ，在加入样品c D N A 前使其回温至室温）： IOOngcDNA (不要多加）； 6]^110\转录缓冲液； 6一 IOXrNTP 混合液； 3jul 100mmol/L D T T ; 2. ip. 1 10mmol/L Bio-II-U T P ； 2. 4jul lOmmol/L Bio-ll-C T P ； 2|u l R N A 酶抑制剂； 2M 1 2500U/V 1 T 7 R N A 聚合酶； D E P C 处理的H 2O 加至总体积为6〇4。 37°C 孵育 8h 至过夜。若有需要可在纯化前于一80°C 保存< 4 8 h。 10. D E P C 处理的H 2O 加至总体积为10(^1，加入R L T 缓冲液350^1 (不含2-巯基乙醇），混匀。加人 250W 乙醇，混匀。上样至外套收集管的RNeasy mini柱。室温 8000g 离心。 11. 转移柱子至一新收集管。加入50〇4 R P E 缓冲液。室温 8000^离心。加人 500pl R P E 缓冲液，室温最高速离心2min。 12•转移柱子至一新收集管，加入 50M 1 D E P C 处理的H 2O , > 8 0 0 0 g 离心 I m i n 。重复洗脱步骤，合并两次洗脱液。用分光光度计于260n m 确定体外转录（ IVT) RNA 的产量（附录3D) 。 1 3 . 将 10Mg R N A 用 DEPC处理的H2O 加至总体积为2知 1。加入 6^1 5 X 裂解缓冲液。小心混匀， 95°C孵育 35m i n 。冷却至室温。一 80°C保存裂解的R N A不超过1 年。$

用前于 37°C融解 5min 。 14. 配制 2X M E S 杂交缓冲液： 8. 3ml 12X M E S 缓冲液； 17. 7ml 5mol/L NaCl; 4. Oml 0. 5mol/L E D T A 0 •Iml 1 0 % Tween-20 ； 18. 9ml D E P C 处理的 H 2O ; I. Oml 50mg/ml B S A 。 65°C 加热 lOmin。 0. 2|txm滤器过滤。一20°C 保存。 15. 为每个反应配制如下 170jul杂交 master混合液： IOOjLtl 2X M E S 杂交缓冲液； 1. 7卜1 10mg/ml 鲑鱼精 D N A ; 2 0 ixl 500pmol/L Bio948； IOjUl 20 X 杂交对照转录池； 38. 3julDEPC处理的 H 20 。 1 6 . 向 30|ul裂解的 R N A 加人 I7OjuJ杂交 master混合液。 99°C加热 lOmin ， 37°C孵育 > 5min 。最高速离心 5min 〇 17 . 将一个 T i p 头插入基因芯片的上层隔膜作为开口。用 1 〜200/al上样 T i p 头将 16L 7^1杂交混合液从芯片的底层隔膜注人。去除开口，用透明胶带封闭上层和底层隔膜。每个 I V T R N A 使用一个基因芯片。 18. 置于振荡器上，约 6〇 r/min， 4〇° C 烤箱孵育过夜（16〜18h) 。将芯片转移至50°C 烤箱，继续置于旋转仪上旋转lh。将芯片从烤箱中取出，将一个T i p头插入其上层隔膜给芯片开一个口。 19. 使用移液器，将其活塞推至底部，将一个 2 0 0 4 的上样T i p 头插入下层隔膜。将芯片垂直，吸出所有的杂交溶液至一微量离心管，于一 20°C 保存。 2〇.将芯片注满I X M E S 杂交缓冲液。按照产商的要求清洗芯片并染色，尽快扫描。若不能马上清洗芯片，用透明胶带封闭上下隔膜，可于 4° C 保存几个小时。若芯片被染色后不能马上扫描，可包裹于铝箔中4°C 保存数小时。 21.处理数据并评估产量（基本方案2)。支持方案1 对照基因的体外转录和转录池的制备附加材料（基本方案1) 质粒（表 11. I.I; A T C C #87482 至并 87490) 25mmol/L 4rNTP 混合液：溶于 D E P C 处理的 H 2O 的 r G T P 、 rC T P 、 rATP 和 U T P 各 25mmol/L .(Ukrapure 公司； Amersham Bioscience 公司） 2500U/pl T3 RNA 聚合酶（ Enzo Diagnostic 公司）

$1.制备线性化的质粒模板（表 11. 1.1)并纯化（基本方案1，第 7〜8 步）。用 D E P C 处理的 H 2O 重悬沉淀至约0. lmg/m l ，定量 D N A (支持方案2)。 2. 为标记的杂交对照转录本配制如下4 管混合液（或预先配制，置冰上< 3 h ，在后续操作前使其回温至室温）： 6“ I O X 转录缓冲液； 6 4 IOX r N T P 混合液； 3jLtl 100mmol/L D T T ； 2. 4^1 10mmol/L Bio-ll-U T P ； 2. 4^1 lOmmol/L Bio-11-C T P ； 2W R N A 酶抑制剂； 2 4 2500U / 4 T 7 R N A 聚合酶； D E P C 处理的 H 2O 加至总体积为60|ul (包含第4 步的 IOOng D N A )。 3. 为未标记的合成转录本按第2 步配制4 管反应液，注意如下差别：用25111]11〇1/[4办11>混合液代替10\办丁？混合液；除去生物素标记的核苷；用 T 3 I^N A 聚合酶代替T 7 R N A 聚合酶。 4 . 向每管分别加入一种线性化的质粒D N A IOOng (不要多加）， 37°C 孵育 8h 至过夜。体外转录（ I V T ) 的 R N A 可于一80°C 保存。纯化产物（备选方案）并用 A 26t5nm确定产量（附录3D )。 5. 用 D E P C 处理的 H 2O 将未标记的合成的对照转录本稀释至200nmol/L 用于长期保存（一80°C 保存不超过1 年）。如下用D E P C 处理的 H 2O 配置转录池（分装至50〜 1(%1每管，一80°C 保存不超过6 个月）： 10pmol/L L Y S 转录本； 30p m o l / L P H E 转录本；$

90pmol/L THR 转录本； 180pmol/L TRP 转录本。 6 . 片段化生物素标记的杂交对照转录本（基本方案1，第 13步）。在 IX M E S 杂交缓冲液中用鲑鱼精DNA稀释至20nmol/L用于长期保存（一80°C保存不超过1 年）。如下 (在同样的缓冲液中与鲑鱼精DNA混合）配置20X转录池（一80°C保存不超过6 个月）： 30p m d /L 片段化的BioB转录本； 100pmol/L 片段化的BioC转录本； 500pmol/L 片段化的BioD转录本； 2nmol/L 片段化的C R E 转录本。备选方案固相可逆固定纯化c D N A 和体外转录产物这种纯化c D N A 或 IVT R N A 的方法与在基本方案1 (第 7〜8 步或第10〜12步）中所描述的方法效果相当，但很容易实现自动化。材料（标V 的条目参见附录 I ) 竣基包被的磁珠（用于 c D N A 纯化的PerSeptive BioSystems; I V T 纯化的Bangs 实验室） V 〇 • 5mol/L E D T A 纯化的样品： cDNA反应混合液（基本方案1，第 6 步）或 IVT R N A 反应混合液 (基本方案1，第 9 步，支持方案1，第 4 步） 2, 5moi/LNaCl/20% (m /V ) PEG 8000 (分子生物学级，无 R N A 酶） 70% O V V ) 乙醇（用 D E P C 处理的H 2O 配制） 10mmol/L Tris 乙酸， pH7. 8 (无 R N A 酶）磁性座子（ C P G ) c D N A 纯化 la. 置 IOjixl PerSeptive竣基包被的磁珠于一 I.5m l 微量离心管中。将管子置于磁性座子上使得磁珠分离至管壁。用移液器小心除去上清液。 2a. 加人 5mol/L E D T A 重悬磁珠，轻微振荡或吹打。将离心管置于磁性座子上，等磁珠分离后，去除上清液。重复两次。用 l( V l 0.5mol/L E D T A 重悬磁珠。 3a. 每 150jul cDN A 反应混合液加入 15〇 W 2. 5mol/L NaCl/20% P E G 8000 和 Ioy 重悬的磁珠，轻微振荡或吹打混匀。室温孵育lOmin。 4a. 将管子置于磁性座子上使得磁珠分离至管壁（最初的分离需约2min，洗涤更快）。去除上清，用 150W 7 0 % 乙醇洗涤磁珠两次。尽量去除乙醇，空气干燥2min。 5a. 加人25^1 10m m 〇 l/L Tris乙酸， p H 7. 8 , 室温孵育5min。将离心管置于磁性座子上，保留上清液（如 ekited c D N A )。用 PicoGreen荧光染色测定c D N A 浓度（支持方案

I V T R N A 纯化 Ib. 置 20|ul羧基包被的磁珠（B a n g s实验室制备）于一 1.5m l 微量离心管中。将管子置于磁性座子上使得磁珠分离至管壁。用移液器小心除去上清液。 2b. 加人ZO^J O .Smol/L E D T A 重悬磁珠，轻微振荡或吹打。将离心管重置于磁性座子上使磁珠分离，去除上清液。重复两次。用 2〇 jul 1.25mol/L NaCl/10% P E G 重悬磁珠。 3b•每 60ylIVT R N A 反应混合液加入 60jul2. 5mol/L NaCl/20% P E G 8000 和 20jl J 重悬的磁珠，轻微振荡或吹打混匀。室温孵育lOmin。 4b. 将管子置于磁性座子上使得磁珠分离至管壁（最初的分离需约2m i n ，洗涤更快）。去除上清，用 1 5 ( ^ 1 7 0 %乙醇洗涤磁珠两次。尽量去除乙醇，空气干燥3m i n。 5b. 加入25/lJ 10m m o l / L Tris乙酸， p H 7. 8,.室温孵育5m i n。将离心管置于磁性座子上，留上清液（如 eluted R N A )。用 A 26chm确定R N A 产量（附录3D )。支持方案2 C D N A定量 I 材料 PicoGreen d s D N A Quantitation Kit (Molecular Probes)： lOOng/Vl标准D N A 储存溶液 20 X T E 缓冲液 PicoGreen 试齐Ij 待定量的c D N A (基本方案1 或备选方案）黑壁的96孔板（ Corning) 突光计（Molecular Dynamics, model FSI) 1. 用 I X T E 缓冲液稀释储存溶液以配制lml 2jug/ml稀释的标准D N A 。用 I X T E 缓冲液按 1 : 200 (V /V ) 稀释PicoGreen试剂。配制足够IOOjuI /孔的稀释试剂。 2 . 向黑壁9 6 孔板中的7 孔分别加入1〇〇、 50、 20、 10、 5、 2 和 0 的稀释的标准 D N A 。用 I X T E 缓冲液将每孔加至总体积为1〇〇 4 (标准D N A 的终含量分别为200、 100、 40、 20、 10、 4 和 Ong/孔）。按需要，加 2 ^ 待定量的cDNA于一新孔。 3. 每孔加入IOOiLxl稀释的PicoGreen试剂，用荧光仪测荧光强度。 4•按厂商的说明书读每孔的荧光强度值。根据每孔的荧光强度值对应的纳克数画出标准曲线。计算样品孔中cDNA浓度。

来源：丁香实验

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