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    设 计 和 克 隆 一 个 s h R N A 到 慢 病 毒 沉 默 载 体 中 ：版 本 B

    相关实验：研发表达 SiRNA 的慢病毒载体实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    寡聚核苷酸；浓度大约2 ( % mol/L pENTR/U6 (Invitrogen) 蛋白酶K< ! > 限制性内切核酸酶： A w l、 B m I、 C k l、 iV^ M 、 X h I STBL3 (Invitrogen或相似的重组缺陷菌株） 设备 PC R 仪 方法 1. 在基因中选择一段靶标序列来沉默，如对于GFP: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC (Tiscornia et al.2003) 0 2. 设计一个shRNA并将其克隆到pENTR/U6 中。图 3a 为 pENTR/U6 图示。更为详 细的图示可以从Invitrogen网站上下载到。 pENTR/U6 有 一个c o lB 毒性基因，必 须在有抗性的菌株如£： • 〇 )“ DB3. 1 中扩增。用 对 这 种 质 粒 切 割 后 产 生 如 下 片段： XXXXX 3, 5，TTTTTXXXXXXX XXXXXGTGG 5， 3' AXXXXXXX 为了克隆shRNA，设计两个与pENTR/U6 酶切片段互补的寡聚核苷酸，然后复性， 连 接 （图 3b、 c、 d)。对于上述的G FP靶序列，复性后，所需的寡核苷酸序列如下： SrCACC GCAAGCTGACCCTGAAGTTC ITCAAGAGA....... 3, CGTTCGACTGGGACTTCAAG AAG1TCTCT.. ... GAACTTCAGGGTCAGCTTGC3' ... CTTGAAGTCCCAGTCGAACG AAAA 5， 其中发夹序列的正义链用斜体标记，黑体为环序列，发夹序列的反义链有下画线。 3•复性并按以下步骤克隆： a. 制备复性混合液 5W P1 (终浓度 50jumol/L) 5pl P2 (终浓度 50^mol/L ) 化I 10 X 复性缓冲液 8 4 H2O b. 加热到94°C ， 5min。使 用 PC R 仪 ，以 0. l ° C /s 的速率降温到25°C 。 甚至 在 终 浓 度 为 5(V m ol/L 时 ，反 应 效 率 也 只 有 5 0 % 。复性效率可以用复性寡聚核苷酸 (5^1 100倍稀释复性混合物）于 4 % 琼脂糖凝胶电泳来确定。单链寡聚核苷酸以发夹结构 形式电泳后位于大约30b p 长的部位，而复性产物的大小应位于55bp 左 右 。 c. 用水稀释复性混合物1000倍 ，将它们克隆到PENTR/U6 载体。一般， 50ng载 体 与 2〜3；xl 1000倍稀释的复性产物连接。转化感受态细菌并在卡那霉素培养皿 中筛选，最终得到的质粒结构见图3d。
    d. 用 酶 切 菌 落 中 得 到 的 质 粒 DNA, 继而跑4 % 琼脂糖凝胶电泳。阳性 克隆会包含一段大约127b p 的插入片段，没有插人片段的菌落质粒为76bp。 hU6-F (GGACTATCATATGCTTACCG) 和 M13-R 引物扩增测序，检查发夹 序列的完整性。 . 4. 沉默盒的检验可参照方案1 中的步骤5。找到一个合适的候选shRNA之后就可以通 过一个L R 重组反应将沉默盒从进人载体转入到终末载体中。图 3e 为典型终末载体 图示。 a. L R 重组反应，加人： 100〜300ng进入载体 150ng终末载体 知1 5X L R 缓冲液 加水至终体积20；xl b. 室温孵育过夜。 c. 加 入 2jul蛋白酶K ，‘37°C孵 育 lO m in。 d. 2^1 L R 反应混合物转化STBL3感 受 态 细 菌 （或类似的重组缺陷菌株） ，氨苄青 霉素平皿中培养。 最终构建物的结构见图3f。使用重组缺陷型细菌可以进行高效重组，因为使用其他菌株质 粒会发生不需要的重组事件。 e. 用 QaI-A m I酶切质粒DNA。包含沉默盒的克隆应该有一个大约700bp的插入 片段，非重组原终末载体有一个I. 9 k b 的插入片段。用 hU6-F (5'-GGA CTA TCA TAT GCT TAC CG~3')测序阳性克隆。 5 . 至于载体的准备，可参阅方案1 中的步骤6〜15。

    来源：丁香实验

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