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        NK/L A K 细 胞 杀 伤 活 性 的 检 测

        相关实验：NK/LAK 细胞杀伤活性的检测

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方案 51C r 释 放 法检 测 NK/LA K 细胞杀伤活性

        材 料

        效应细胞：自然杀伤细胞（natural killer， N K ) (单元8. 6)、淋巴因子活化的杀伤 细 胞 （lymphokine-activated killer， L A K ) ，或外周 P B M C (单元 8. 1 ，按照附 录 1 ，采用非连续Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离） V R P M I -I O 完全培养基，用 于 N K 细胞培养 51C r 标记的靶细胞，用 R P M I -I O 调整浓度为5 X 104个细胞/ml (见辅助方案） 含 5 % (VyV) TritonX-IOO 的 PBS IOml圆底带盖聚丙烯塑料试管 9 6 孔圆底细胞培养板（Costar) 8 道 移 液 器 （如 Titertek、 ICN Biomedicals) Sorvall R T 6000离心机及HlOOOB转 子 （或替代品） 7 液闪和配套试管 1 . 台盼蓝拒染法测定效应细胞的活力（附 录 3 0 。将细胞悬液加入I O m l 圆底带盖聚丙 烯塑料试管中，用 R P M I -I O 培 养 基 调 整 到 合 适 浓 度 ，以 满 足 效 应 细 胞 ：靶细胞 (E : T )起始比率所需。如起始E •• T 为 5 0 : 1 时 （对于;P B M C )，效应细胞的浓度应 为 2. 5X 106个细胞/m l ; 起 始 E : T 为 6 : 1 时 （对 于 L A K 细胞），效应细胞的浓度 为 3. 125 X I O 5个细胞/ml (表 8. 14. 1)。2 3 表 8.14.1 4h 51Cr释放法检测健康志愿者PBMC来源的NK细胞和LAK细胞的杀伤活性: 靶细胞 不同效/ 靶 比 时 的 杀 伤 百 分 率 （均数士SD) 杀伤单位 杀伤单位 50 : 1 25 J 1 12 ： 1 undefined1 undefined1 1. 5 •• 1 0. 75 : I (LU2 〇/107个细胞) 范围b NKc LAKd 45±16 30士14 20士9 11±6 57±14 44士13 154±95 30±12 18±9 1926±1244 53〜 301 140 669〜 3736 134 a. 缩 写 ： LAK，淋巴因子活化的杀伤细胞； NK，自然杀伤细胞； LU2 。， 20%裂解时的 裂 解 单 位 ； n , 例 数; PBMC，外周血单个核细胞； SD，标准差。 b . 正 常 50%〜80%范围。 c . 新鲜分离的PBMC对 K562靶细胞的杀伤活性。 d. PBMC经 6000U/mlIL-2体 外 培 养3d后 ，对 Daudi细胞的杀伤活性。 2 . 轻轻混匀效应细胞，在 9 6 孔 板 B 行 的 第 1〜3 孔中各加入200^1效 应 细 胞 悬 液 （图 8.14.1)。同样将其他待测效应细胞悬液加入到C 〜H 行 的 第 1〜3 孔中。一 块 9 6 孔 板最多可同时检测7 个样品。 3 . 用 8 道 移 液 器 ，在 B 〜 H 行 第 4 〜 1 2 孔 中 各 加 入 100/xl R P M I - I O 培 养 基 （图 8. 14. 1)。从 B 〜H 行 第 1 列各孔中吸取100/xl液体加到B 〜H 行 第 4 列对应各孔中， 混匀。然后将第4 列中的液体各取IOOiUd加 到 第 7 列的对应孔中，混匀。继续将第7 列各孔中的液体吸取IOOm I加入到第1〇列相应的各孔中，混匀。最后将第1〇列各 孔中的液体吸弃100/^1。剩下的两列复孔重复上述操作，即将第2 列各孔中的液体依 次稀释到第5、 8 和 1 1 列 ；第 3 列各孔中的液体稀释到第6、 9 和 1 2 列
        4 . 用 R P M I -10将51C r 标记的靶细胞调整为5 X IO4个细胞/m l ，在 A 〜H 行各孔中加入 IOOiU l靶细胞悬液。然 后 在 A 行 第 1〜6 孔 中 加 入 100M1 R P M I -10培 养 基 （自发释放 对照组）；在 八 行 第 7〜 12孔 中 加 入 10(^15%丁 出 〇11义-100(最大释放对照组）
        5 . 室温， 200g•离心3min，缓慢减速。将 培 养 板 置 37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养 4h 。培养时，避免将培养板互相叠放。 6 . 用 8 道移液器小心吸取50M1或 IOOm I培养上清加入相应的7 计 数 管 中 （此时也可采 用自动收集系统）。 7 . 用 y 液闪仪检测各样品的51C r 放 射 值 （包括对照孔和实验孔）。根 据 公 式 计 算 N K / L A K 细胞特异杀伤百分率。 杀伤率％= l〇〇X : 实验孔平均c p m — 自发释放孔平均cpm '最大释放孔平均cpm— 自发释放孔平均cpm 8 . 为 比 较 不 同 效 应 细 胞 及 不 同 E : T 条 件 下 的 杀 伤 活 性 ，结果可用杀伤单位表示 (L U ; 如 表 8. 14.2)。一 个 L U 代 表 杀 伤 一 定 百 分 比 （如 2 0 % ) 标准靶细胞所需的 效应细胞数量。 表 8.14. 2 头颈部肿瘤患者经IL -2治疗后，外 周 血N K 细 胞 和L A K 细胞杀伤活性的变化a，b 细胞杀伤活性（LU2Q /107个细胞） 例数 P 值 IL-2治疗前 IL-2治疗后 NK (杀伤 K562) c 100士12 158士12 26 0. 005 LAK (杀伤 DaudDd 1000士130 1995士150 23 0.0006 LAK (杀伤 SCCHN)d 316士23 631士50 20 0. 015 a. 缩写： IL-2，白细胞介素2; LAK，淋巴因子活化的杀伤细胞； NK，自然杀伤细胞； P ，差异显著性水平; SCCHN，头颈部鳞状上皮癌。 b•数据摘自 Whiteside 等， 1993。 c. 新鲜分离PBMC的杀伤活性。 d. PBMC经 6000U/ml IL-2体外培养3d 后的杀伤活性
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        来源：丁香实验

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