淋巴细胞增殖实验

最新修订时间：2024-05-13

原理

淋巴细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在24——48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。

（1）非抗原性刺激物：如植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS），通称促有丝分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。

（2）抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。

材料与仪器

实验材料	PBMC细胞悬液
试剂、试剂盒	RPMI-10完全培养基 100ug ml的植物血凝素
仪器、耗材	96孔板圆底细胞培养板

步骤

基本方案丝裂原诱导的外周血单个核细胞增殖实验

材料

其他多克隆刺激因子与T 细胞表面抗原受体或辅助分子结合后，可诱导相应细胞的增殖，本方法调整后，也适用于检测这些因子诱导的细胞增殖（表 8. 8 . 1 和表 8. 8. 2)〇表 8. 8 . 1 诱导淋巴细胞增殖的活化剂 a 细胞类型靶分子活化剂 T 细胞 TCR 特异性抗原 TCR-a 和 TCR-p 抗 TCR MAb TCR相关 CD3 抗 CD3 PHA CD2 抗 CD2和 PHA CD28 抗 CD28 MAb B 细胞膜表面Ig 抗 IgM和抗 IgM SAC微球 CD20 CD20 MAb CR2病毒受体 EBV BCGF受体 BCGF B 细胞和T 细胞离子通道 A23187伊诺霉素离子载体 PKC 佛波酯 CD25 (IL-2R|3 链） IL-2 IL-4R IL-4 a .缩写： BCGF， B 细胞生长因子； EBV， EB病毒； Ig，免疫球蛋白； IL，白细胞介素； MAb，单克隆抗体； PHA，植物血凝素； SAC，葡萄球菌A 蛋白； TCR， T 细胞受体。表 8 . 8 . 2 常用人淋巴细胞活化剂的来源和剂量范围活化剂a 来源b 剂量范围抗原破伤风毒素 Wyeth 1〜20/ig/ml PPD Parke-Davis 1〜10/xg/ml 丝裂原 PHA Wellcome Diagnostics 1〜10|ug/ml ConA Miles Laboratories 1〜10/xg/ml 美洲商陆蛋白 GIBCO/BRL 1 : 100稀释细胞同种非T 细胞单元 8. 2 1 : 1〜 : M 10刺激细胞/反应细胞自体非T 细胞单元 8. 2 1 : 1〜 1 : 10刺激细胞/反应细胞离子通道伊诺霉素 Calbiochem 0. 5/Ltmol/L 佛波酯 PMA Sigma 0. 5〜10ng/ml 抗体抗 CD3单抗（杂交瘤） ATCC 3 倍系列稀释法确定剂量交联的抗IgM BioRad 10〜50/utg/ml 抗体

P B M C 细胞悬液（单元 8.1) V R P M I -I O 完全培养基 100Mg/ml 植物血凝素（phytohemagglutinin， P H A ) ， R P M I -10 完全培养基配制 (分装，一20°C 保存） 9 6 孔圆底细胞培养板 1•计数P B M C (附录3A ) ，加入 R P M I -10完全培养基，调整浓度至I X l O 6个细胞/ml。细胞混匀后，在 9 6 孔板每孔中加入 IOOm I 细胞悬液（每孔 I X IO5个细胞；图 8.8. 1)。各实验组设3 复孔（如丝裂原的不同浓度组）。不加丝裂原的对照孔作为本底，同样设3 复孔。 2•用 R P M I -10 完全培养基将 100Mg/ml P H A 分别按 1 : 10、 1 : 20 和 1 : 40 (V 7V ) 进行稀释。在 9 6 孔板的第 1〜3 列（本底）每孔中加入 IOOmI R P M I -10完全培养基; 在第 4〜6 列中加入 1 : 4 0 稀释的 P H A 溶液 IOOiUl (终浓度 2. 5]ug/ml) ，在第 7〜9 列中加入1 : 2 0 稀释的 P H A IOOmI (终浓度 5Mg/ml) ，在第 10〜1 2 列加入 1 •• 1 0 稀释的 P H A IOOmI (终浓度 10Mg/ml)。操作时应避免不同浓度或不同样品间的交叉污染。培养板置 37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养3d 。 3. 3H T d R 掺入及后续检测参见辅助方案

备选方案 1 单向混合淋巴细胞反应

附加材料（其他材料见基本方案）

R P M I 完全培养基（R P M I -10A B ) (附录 1 ) : 含 1 0 % 人 A B 血清， 56°C ， I h 灭活

同种异体刺激细胞（P B M C ; 单元 8.1)

自体刺激细胞（P B M C ; 单元 8. 1)

丝裂霉素 C 溶液， 0.5m g /m l ， R P M I -10A B 配制（避光，无沉淀），或细胞照射二活设备
$图 8. 8 . 1 淋巴细胞增殖实验示意图。 A. 此方法适用于检测不多于3 种不同刺激诱导下不多于8 种同种异体淋巴细胞（A〜H)的增殖反应。 B. 此方法适用于不多于7 种不同刺激(B〜H)诱导下不多于4 种同种异体淋巴细胞的增殖反应。 1 . 计数？ 8^1(： (附录3八），用 1 ^ “ 1-10八3完全培养基调整浓度至1\106个细胞/1111。 2 . 在同种异体P B M C 刺激细胞和自体I124B M C 3 刺激细胞（对照组）中，加入 0.5mg/ml 丝裂霉素C 至终浓度25iug/m l 。置 37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中作用30min，然后用 R P M I -10A B 完全培养基将细胞至少洗涤3 遍。细胞也可用2000rad照射灭活。调整细胞浓度至I X IO6个细胞/m l 。 3•混勻P B M C 反应细胞，立即在 9 6 孔平底板中加入100M1细胞悬液。每实验组设3 复孔。在相应孔中分别加入100/^1照射灭活后或丝裂霉素C 处理后同种异体或自体刺激细胞。对照组每孔中加入 10CV1 R P M I -10A B 完全培养基。培养板置 37°C ， 5 % C O 2细胞培养箱中培养5〜7d。 4. 3H T d R 掺入及后续检测参见辅助方案$ $备选方案 2 抗原诱导的T 细胞增殖实验此方法经调整后也适用于蛋白质或多糖抗原诱导的T 细胞增殖实验（表 8. 8. 2)。附加材料（其他材料见备选方案1) T 细胞（单元 8, 2 和 8. 3) 自体抗原呈递细胞（非 T 细胞；单元 8. 2 和 8. 5) 破伤风毒素 (Connaught ^ State Laboratory Institute of Massachusetts) 1 . 计数丁细胞（附录3八），用1^^1-10八8完全培养基调整浓度至1\106个细胞/1111。 2 . 参照备选方案I 中步骤2 , 用丝裂霉素C (或 2500rad照射）灭活抗原呈递细胞。调整浓度至2 X IO5个细胞/ml。 3 . 在 9 6 孔板中加入IOOm I T 细胞悬液和50M1灭活后抗原呈递细胞悬液，每种细胞在加样前应混勻。加入破伤风毒素至终浓度分别为〇、 1、 5 、 1 0 和 20pg/m l 。每浓度设3 复孔。培养板置37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养6d 。 4. 3H T d R 掺入及后续检测方法参见辅助方案。辅助方案 3H TdR 掺入和细胞收集材料 50/xCi/ml 3H TdR [6. 7Ci/(mmol/L) ; Amersham 或 ICN Biomedicals] ， RPMI-10 培养基配制（附录 1) 100% C W V r) 甲醇闪烁液（ Ready Safe 或 Beckman) 同步细胞收集器（推荐使用半自动收集器； Cambrige Technology， Beckman， Pharmacia L K B Biotechnology 或 Skatron)，蒸锻水及蒸傭水罐细胞收集器配套用滤纸，临用前用蒸镏水浸湿灯和镊子（推荐使用）液闪管 1 . 细胞培养终止前611或18}1，在每孔中加入2(^1浓度为5(^(：丨 /1111的3； «丁(111(每孔 1.0|^〇 )。可适当延长311丁411掺入时间。 2 . 使用全自动同步细胞收集器，洗涤、裂解细胞，并将 D N A 转移到滤纸上。每列细胞洗涤及吸引至少1 0 次以确保细胞D N A 被充分转移至滤纸上，且彻底洗掉未掺入的 3H T d R 。 1 0 0 % 甲醇洗涤滤纸条，使滤纸条易于干燥。使用半自动细胞收集器时，需将滤纸片放入对应的闪烁管中。人工收集时，将滤纸片置灯下烘干，然后用镊子将滤纸加入对应的闪烁管中。最后在闪烁管中加入闪烁液。 3 . 用液闪仪检测样品的c p m 值，要求标准差< 2 % 。计算本底和样品的平均 c p m 值复孔的变异度应〈 2 0 % 。 4 . 根据仪器使用说明书彻底清洗细胞收集器。$

注意事项

1. 细胞培养液终止前6h或18h，在每孔中加入20μL浓度为50μCI/ML的氘代TDR，可适当延长TDR渗入时间。

2. 根据仪器使用说明书彻底清洗细胞收集器

常见问题

使用全自动同步细胞收集器，洗涤，裂解细胞，并将DNA转移到滤纸上，且彻底洗掉为渗入的氘代TDR，100%甲醇洗涤滤纸条，使滤纸条易于干燥，使用半自动细胞收集器时，需将滤纸片放入对应的闪烁管中，人工收集时，将滤片置于灯下观察烘干，然后用镊子将滤纸加入对应的闪烁管中，最后在闪烁管中加入闪烁液。

本实验来自《精编免疫学实验指南》，作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等

来源：丁香实验