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    ELISPOT方 法 检 测 分 泌 细 胞 因 子 的 细 胞

    相关实验：ELISPOT 方法检测分泌细胞因子的细胞

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基本方案

    材 料


    包被缓冲液

    洗液：含 0.25% (v/v) Tween 20 的 PBS 溶液

    阻断缓冲液：含 5 % (m/V) BSA 或 FCS 的 PBS 溶液

    VRPMMO 完全培养基（或其他适宜培养基）

    分泌细胞因子的细胞（小鼠或人的）

    丝裂原，抗原或其他促细胞因子分泌的刺激物

    带有标记物的细胞因子特异性二抗
    a . 最终的工作浓度。 b . 供应商： C， Chromogenix; E， Endogen; G， Genzyme; LB， LeeBiomolecular; Ph， Pharmingen。各供应商 地址见附录4。 c . 与三抗联合应用，如碱性磷酸酶结合的羊抗兔的IgG (Fe-特异性，详 见 附 录1) 。 ELISP0 T 稀释缓冲液：含 1 % (m /V ) B S A 的 P B S 溶液 适用于所检测细胞的检测抗体或蛋白 碱 性 磷 酸 酶 （alkaline phosphatase， A P ) 或 辣 根 过 氧 化 物 酶 （horseradish peroxidase， H R P ) 偶联的链亲和素 （用于人的检测； JacksonInmmunoresearch) A P 偶联的亲和素D (用于小鼠的检测； Vector) A P 或 H R P 偶联的羊抗兔 IgG (Fe 特异性； Jackson Inmmunoresearch) V P B S 溶液 B C I P / N B T 溶 液 （Kkkegaard& Perry; 现用现配）或 氨 乙 基 咔 唑 （aminoethylcarbazole， A E C ) 溶 液 （附录 1) 9 6 孔硝酸纤维素膜微孔板（Millipore) 37°C ， 5 % C 0 2培养箱 解剖显微镜， I O X 或 30X 放大倍数 1 . 加 入 50W 含有细胞因子特异性一抗的包被缓冲液至硝酸纤维素膜微孔板的孔中。盖 上盖子或塑料封条。常温下孵育2h 或 4°C 孵育过夜。 最佳抗体浓度应预先设定（表 5. 11.1)。根据不同的ELISP0 T 检测选择最佳的 包被条件。 包 被 抗 体 的 浓 度 通 常 是 常 规 E L I S A 所 用 浓 度 的 5 〜 1 0 倍 （如 5 〜 lOyg/ml)。抗 体 通 常 稀 释 于 碳 酸 盐 缓 冲 液 中 （p H 9.6)。在一些实验中，也可采用 ? 8 3 ( ? 幵 7 . 2 〜 7 . 4 ) 或 硼 酸 盐 缓 冲 液 （卩118.4)。 2 . 倾倒包被抗体液。用 洗 液 洗 涤 3 次 [2004/(次•孔)]。最后一次甩掉剩余的洗液，
    并在灭菌的吸水纸上扣干。 3 . 每孔加入200/^1阻断液， 37°C 孵 育 30min。 4 . 倾倒阻断液。用洗液洗涤3 次 [20(^1/(次•孔)]。最后一次甩掉剩余的洗液，并在 灭菌的吸水纸上扣干。 5 . 每孔加入100/xl R P M I -10完全培养基，室 温 孵 育 IOmin后倾倒孔中的液体并在灭菌 的吸水纸上扣干。 6 . 在另外一块微孔板上用R P M I -10完全培养基准备2〜4 倍稀释浓度的细胞悬液。向 包被板的每孔加入总量< l〇〇iul的单细胞悬液，起始细胞数为IO5个细胞/孔 或 IO6个 细胞/孔 。每个实验条件设立3〜4 个复孔。如果条件允许，可以设立一个已知的分 泌待测细胞因子的细胞系作为阳性对照。 准备好的细胞尽可能快的铺板。对于外周血细胞，破碎红细胞的步骤是必需的 (单元2.1)，而对于小鼠的脾细胞，破红步骤则不是必需的。 7 . 向细胞中加入丝裂原，抗体或其他促细胞因子分泌的刺激物。未 刺 激 的 细 胞 （只有 培养基）作为背景对照及体内激活的对照。 有关刺激细胞的操作见单元2. 11、 2. 12、 8. 8 及 8. 15。 为防止细胞因子的再分泌（相对于原有的已分泌的细胞因子），可以设置加入蛋 白抑制剂如环磷酰胺（100Mg/ml) 的对照。环磷酰胺应加入3〜4 个复孔，而且刺激 和未刺激的细胞组都要有此对照，并于孵育的初始加入。 8 . 将细胞于37°C ， 5%(：0 2培养箱中水平放置培养6〜24h。 最佳的培养时间应根据待测细胞因子及刺激物而定。如果培养时间过短，则最 终的斑点数会有所减少。而如果培养的时间过长，则背景会随之升高。 9 . 每 孔 用 200/xl洗液充分地洗涤1 0 遍从而完全地移除细胞。如需要，最后一遍采用双 蒸水洗涤裂解残存的细胞。最后甩掉剩余的洗液，并在灭菌的吸水纸上扣干。 1 0 . 每 孔 加 入 50M1 含 标 记 的 细 胞 因 子 特 异 性 二 抗 的 E L I S P O T 稀 释 缓 冲 液 。室温孵 育 2h 。 适合的抗体浓度应预先设定（表 5. 11.2)。 11. 倾倒二抗缓冲液。用 洗 液 洗 涤 6 次 [200M1八次•孔)]。甩掉剩余的洗液，并在灭 菌的吸水纸上扣干。 1 2. 每孔加入50/xl A P 或 H R P 偶联的检测抗体或蛋白质（如亲和素、链亲和素或羊抗 兔 I g G ) 后室温孵育2h 。 适合的抗体浓度应预先设定。 13.用洗液洗涤6 次 [200^1/(次•孔) ] 并拍干。用 P B S 洗 涤 1 次并拍干。 14•每孔加入50/^1 BCIP/N B T 溶 液 （对 于 A P ) 或 50M1 A E C 溶 液 （对 于 H R P ) ，室温 孵 育 5〜30miri直 至 蓝 色 斑 点 （A P ) 或 褐 色 斑 点 （H R P ) 形成。 每个阳性对照孔都应有斑点形成（1 0 0 % 效率）。 15.每孔用200M1双蒸水洗涤3 遍并风干。用 I O X 或 30X 放大倍数的解剖显微镜计数斑 点 。如需要，可釆用成像技术或简单的相片对每个孔逐一进行分析

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    来源：丁香实验

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