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        γ干 扰 素 的 检 测

        相关实验：γ 干扰素的检测

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        基本方案

        材 料

        纯化的特异性抗IFN-y 单 抗 （Genzyme # 1598-00,抗 人 IFN-7; #1222-00,抗小 鼠 IFN-7) V 碳酸盐包被缓冲液 IFN-7 标 准 品 （高 纯 ，如 Genzyme # HG-IFN ，抗 人 IFN-7; # MG-IFN ，抗 小 鼠 IFN-y) 样品缓冲液： PBS (附录 1 ) 含 5 % 0//V ) FCS (56°C热 灭 活 30min) V E L I S A 洗液 山羊或兔抗IFN-7多 克 隆 抗 血 清 （Genzyme) 过氧化物酶标记的抗山羊Ig抗体或抗兔Ig抗 体 （USBiochemical #1144H ，兔抗 山羊； #1251H ，山羊抗兔）（根 据 抗 IFN-Y 多克隆抗血清的种属来源选定） V 底物缓冲液 V 过氧化物酶底物溶液
        多通道移液器 检测板： 96 孔平底 Immulon 2 ELISA 板 和 板 盖 （ Dynatech Laboratories # Oll- 010-3450) 96孔 V 形底微量滴定板 ELISA板 洗 板 器 （可选Bio-Rad 1550) 酶联仪和414nm滤光片 注： Genzyme公司有售包括所有缓冲液、抗体和试剂的试剂盒，可检测人IFN-7 (# 1556-00)或 小 鼠 IFN-7 (# 1557-00) 。 ATCC有售能产生抗小鼠IFN- 7 的特异性 IgG l 单抗的大鼠杂交瘤细胞（RA-6A2 # HB170)。不久将有能产生抗人IFN-7单抗的 其他杂交瘤细胞。 1. 用碳酸包被缓冲液将纯化的抗IFN-7单抗稀释到3. 5Mg/ml。 2 . 用多通道移液器，向检测板的每孔中加人1 0 0 4 单抗稀释液。用板盖盖板， 37°C孵 育 2h 或 4°C放 置 过 夜 （包被过夜可增加敏感性）。 3 . 如下在另一块96孔 V 形 底 板 （稀释板）中系列稀释IFN-7。在 1〜3 列 的 B〜 H 行 的每孔中加125^1样本缓冲液； A 行 加 250MlIFN-7标准品[浓度为100国际参考单 位 （IRU) /ml，含 3.3ng/ml人 IFN-7或 l 〇ng/ml小鼠IFN-7]。用多通道移液器从 A 行各孔分别转移125M1液体到B 行各孔，吹打混匀。如此重复倍比稀释标准品直 到 G 行 各 孔 ，从 G 行 各 孔 吸 弃 125W 液体。 A 〜 G 行 的 浓 度 从 IOOIRUAnl到 0. 78IRU/ml。 H 行是空白对照。 纯化的重组IFN- 7 是最好的标准品。如果先用商品化IFN-7标准品滴定，含 IFN-7的活化T 细胞培养上清液也可作为标准品。标准品和待测样本必须种属相同 且具有相同的单抗特异性。 4•在4〜6 列 ， A 行的每孔加175m1待测样本之一， B〜D 行加140M 1样本缓冲液。用多 通道移液器从A 行各孔分别转移35M 1液体到B 行各孔，吹打混匀。如此重复5 倍稀 释标准品直到D 行各孔，从 D 行各孔吸弃35pd液体。因此待测样本稀释了 125倍， 每个稀释度3 个复孔。 5 . 同样稀释其他待测样本，每个样本3 列X 4 行。 6 . 用 ELISA洗液洗涤已包被的检测板6 次，可 用 ELISA洗板器。如果需要保存，每 孔 加 IOO1Ul ELISA洗液后加盖，检测板可在4°C保存 2 周。 7 . 在吸水纸上拍干检测板。用多通道移液器从稀释板转移IOOmI 稀释液到检测板对应 各孔。 37°C孵 育 Ih 或 4°C放 置 过 夜 （过夜孵育可增加敏感性）。 在洗液中加入Tween 2 0 可减去封闭步骤。 8 . 用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，在吸水纸上拍干检测板。 9 . 用样本缓冲液稀释抗IFN-7多克隆抗血清500〜5000倍 ，每孔加IOOmU 加盖后室温 (20〜25°C) 放 置 lh 。用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，在吸水纸上拍干检测板。 多克隆抗血清的稀释倍数需要根据经验确定。也可用能对IFN-7标准品产生最 大线性OD反应且最低背景的多克隆抗血清的稀释倍数定为最适浓度。 10. 用样本缓冲液稀释过氧化物酶标记的抗山羊IgG或抗兔IgG抗 体 2000〜10000倍 ， 每孔加100/xl，加盖后室温（20〜25°C) 放 置 lh 。用 ELISA洗液洗涤检测板6 次，
        在吸水纸上拍干检测板。 注 解 同 步 骤 9 。 1 1 . 每 孔 加 100/xl过氧化物酶底物缓冲液，室温放置3〇 min〜2h 。在 414n m 波长处读取 O D 值 （阳性孔呈绿色）。 1 2 . 根据标准品的光吸收值（O D ) 在 半 对 数 纸 上 作 标 准 曲 线 （O D 值 对 IFN- 7 浓度绘 图）。根据待测样本O D 值对应标准曲线线性区的稀释度确定待测样本中IFN- 7 的 含量。用该点的标准品浓度乘以该点待测样本稀释度的倒数即为原始样本中所含 IFN- 7 的浓度，要注意平均该样本的全部数值。
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        来源：丁香实验

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