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        I L -1 2 的检测实验

        相关实验：IL-12 的检测实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方 案 人 和 小 鼠 IL-12 p7 5 异 二 聚 体的 E L I S A 检测方法

        材 料

        E L I S A 包被抗体：大 鼠 抗 人 IL-12异二聚体单 克 隆 抗 体 20C 2 (由 R . Chizzonite， Hoffmann-LaRoche提供）或大鼠抗小鼠IL-1 2 异二聚体单克隆抗体9A 5 (由 R . Presky， Hoffmann-LaRoche 提供） V 包被缓冲液 V 洗涤缓冲液 V 封闭液 IL-12 参考标准品：人或小鼠 IL-12 (由 M . Gately， Hoffmann-LaRoche 提供） V 检测缓冲液 含 有 IL-12的待测样品 大鼠抗人 IL-12p40 亚基单克隆抗体 4D 6 (由 R . Chizzonite， Hoffmann-LaRoche 提 供）或大鼠抗小鼠IL-12p4 0 亚基单克隆抗体5C 3 (由 D . Presky， HoffmannLaRoche提供），均偶联辣根过氧化物酶（H R P ) H R P 的 显 色 底 物 （如 K 蓝底物、 ELISA Technologies)，根据生产商的说明配制 适合的底物终止液（如 针 对 K 蓝底物的lmol/L H 3P O 4) 多通道移液器 检测板： 9 6 孔带盖的E I A 板 （如 Immulon II、 Dynatech) 适 合 H R P 底 物 的 E L I S A 读板仪 1•解冻E L I S A 包被抗体，并用包被缓冲液稀释到2.5Mg/ml (抗 人 IL- 1 2 ) 或 5ptg/ml (抗小 鼠 IL-12)。 2 . 立即用多道移液器在检测板的每个孔中加入IOOmI稀释好的包被抗体。盖上盖子于 4°C过夜孵育。 3 . 吸去或倒去板中液体再加入洗涤缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤检测板3 次 。 4 . 每孔加200/xl封闭抗体于37°C 孵 育 I h 或 4°C 过夜孵育。若需要，将包被好的检测板 在 4°C 保 存 于 封 闭 液 中 （至少稳定2 周）。 5 . 用检测缓冲液稀释IL-12参考标准品至lng/m l 。在 1.5m l 的离心管中准备好6 个梯 度 的 2 倍 比 稀 释 （最 终 为 15. 6pg/ml)。 6 . 在 1.5m l 离心管中，用检测缓冲液准备好未知样品的2 倍比的梯度稀释，起始稀释 率 使 IL-12的浓度在1〜0.1ng/m l 范围内。 若 不 能 估 计 未 知 样 品 的 浓 度 ，进 行 4 个 梯 度 的 5 倍 比 的 稀 释 ，培 养 上 清 或 血 清 样 品 都 以 I : 1 为 起 始 稀 释 率 。 7 . 吸去或倒去抗体包被好的检测板孔中的溶液，按照步骤3 洗 板 3 次 。 8 . 加 lOOjul IL-12标准品和未知样品的每个稀释液到包被好的检测板中，每个样品做3 个复 孔。加1〇〇 4检测缓冲液至少到2 个孔中作为背景控制。室温振荡孵育2h 或 4°C 过夜。
        9 . 吸去或倒去孔中液体，按照步骤3 洗 板 5 次 。 10• 用 检 测 缓 冲 液 稀 释 H RP偶 联 抗 体 4D6 至 250ng/m l或 H R P 结 合 抗 体 5C3 至 500ng/ml。 每孔加100/xl稀释抗体，室温孵育2h。 11•按照步骤3 洗 板 5 次 ，然后每孔中加入100W 发色底物。室温孵育10〜15min。 12. 每孔中加入lOOyl终止液，用 E L I S A 读板仪根据H R P 底物对应的波长读板。 13. 绘 制 标 准 曲 线 （吸光度比pg/mlIL-12)，并根据标准曲线计算未知样品中IL-12的 浓 度 （见 单 元 5. 2 中细胞因子E L I S A 计算结果）

        备 选 方 案 人 和 小 鼠 IL-12 p4 0 亚 基 的 E L I S A 检测

        IL-2异二聚体产物常常伴随着IL-12p4 0 亚 基 产 物 的 产 生 （通常> 5 倍 ）。基本方案 里采用能识别IL-12 P4 0 异二聚体和游离形式的亚基的包被抗体用来检测这两种形式的 产物。针 对 人 IL-12,用小鼠抗人IL-12p4 0 亚基单克隆抗体2-3A 1 ( 由 R . Chizzonite， Hoffmann-LaRoche提供），浓 度 稀 释 到 2.5jug/ml 。针 对 小 鼠 IL-12，用 抗 小 鼠 IL-12 p40 亚基抗体 5D9 (由 D. Presky， Hoffmann-LaRoche 提供），浓度稀释到 5/xg/ml。 结合基本方案，这个方法除了可评价IL-12 P 4 0 同源二聚体外还可被用来评价游离 的 p4 0 亚基。这种方法不太适合测定IL-12异二聚体，因 为 IL- 1 2 的 p4 0 亚基在体外和 体内通常以P3 5 亚基形式大量的产生。因此，在一些样品中尽管IL- 1 2 异二聚体的含量 低于检测限度，但少量的IL-12 P4 0 仍可能被检测到。
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        来源：丁香实验

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