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        抗 磷 酸 化 酪 氨 酸 的 印 迹 检 测

        相关实验：抗磷酸化酪氨酸的印迹检测

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方 案 抗 磷 酸 化 酪 氨 酸 印 迹 检 测 的 准 备 及 分 析

        材 料

        一抗： lmg/m l 4 G 1 0 抗磷酸化酪氨酸单抗（UpstateBiotechnology) 或类似抗体
        P B S
        溶于 PBS/0. 0 2 % (m / V ) 叠 氮 钠 的 5 0 % (m /V ) 蛋 白 A -琼 脂 糖 悬 液（Pharmacia
        L K B )
        待分析的细胞
        刺激物
        2 X 和 I X 裂解液，冰冷
        PI/P B S ，冰冷
        lmmol/L 原银酸钠
        I X S D S /上样缓冲液
        封闭液
        含 有 Tween 2 0 的 Tris 平 衡 盐（T B S T )
        二 抗 ：碱 性 磷 酸 酶（A P ) -偶 联 的 抗 鼠 Ig (Promega 或 Pierce; l m g /m l 储存液以
        1 : 7000 稀 释 于 T B S T 中）
        V 显影液
        Combitip 分液管
        连续分液器
        振荡器平台或轨道旋转平台， 4°C 和室温
        95〜110°C 水浴或类似仪器
        0.2/x m 孔径的硝酸纤维素膜（Schleicher& Schuell)
        Whatman 3M M 滤纸
        1•制备4G 1 0 单抗包被的珠子。使 用 Combitip分液管和连续分液器，加 入 4G 1 0 单抗至 一个1.51111微量离心管的侧壁上， 1.5] ^1/个样本。加入0,51111?83。加入50/11的 5 0 % 蛋 白 A -琼脂糖悬液，用 尖 部 削 掉 1〜2m m 的 Combitip分 液 管 （以及移液器枪 头），以防对琼脂糖珠产生剪切破坏。盖上管盖，置于旋转器上4°C 大 于 lh。 2. 按需要刺激细胞，每个样本总体积<〇 . 5m l 。对于体积< 5 m l 的体系，用等体积的冰 预 冷 2 X 细胞裂解液终止反应，立即涡旋混匀，置于冰上裂解20min (到 2h)。对于 体积> 0 . 5 m l 的体系，加 入 4〜1 0 倍体积的冰预冷PI/P B S 终止反应，短时微量离心 以沉淀细胞，吸去液体，以 IO8个细胞/m l 的浓度用冰预冷I X 裂解液裂解重悬并裂 解细胞沉淀物。 3. 将细胞裂解物转移至另一个离心管， 4°C ，高速离心15min。 4 . 离心细胞裂解液的同时，以 短 时 离 心 方 式 （使离心机达到最高速然后停止）洗涤步 骤 1 中 4G 1 0 单抗包被的珠子。吸弃上清仅留50M1，用移液管加1.25m l 的冰预冷I X 裂解液，以适中的速度直接注入管底部。盖上盖子上下颠倒以使珠子彻底重悬。如 前所述短时离心，吸弃上清，留 25〜50W 液体。 5. 将细胞裂解液加到有4G 1 0 单抗包被珠子的管中， 4°C旋 转 3〜6h 。 6. 制 备 SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶。 7. 4°C ，高速离心珠子，吸弃上清。如步骤4 , 用 I m l 冰预 冷 I X 裂解液洗3 次 ，以 Iml 冰 预 冷 lmmol/L 原钒酸钠洗一次。吸弃珠子表面所有的液体。 8. 加 入 lOOjullXSDS/样本缓冲液，重 悬 并 95〜110°C加 热 5min。上 样 并 电 泳 （如标准 的 7. 5 % 、 I O c m X 20cm 胶 ， 45V 电泳 16h)。
        9 . 如 单元12. 5 步 骤 1〜10所述，通过免疫印迹将蛋白质转移至0.2r m 孔径的硝酸纤维 素膜， 50V 电压转膜4h 。 10. 剪除硝酸纤维素膜上不需要的部分。如 果 在 24h 内不使用，则 放 在 Whatman 3M M 滤纸上至干燥，避光、保持干燥放于盒子中（如抽屉中）保存直到使用。 11. 放入封闭液中室温Ih ( 或 4°C 过夜）。封闭及后续的洗膜过程均在振荡器上振荡 进行。 12. 弃去封闭液，加 入 1 : 1 0 0 0 稀释于T B S T 中的4G 1 0 单 抗 （如 用 IOOOml吸头盒盖作 容器则加入20ml)。在轨道旋转器中4°C 孵育过夜，或在振荡器上室温孵育4h 。如 果需要，抗体可重复使用数次（需记录使用次数），加 入 0 . 0 2 % 的 叠 氮 钠 （终浓度） 后 存 于 4°C 。弃去抗体溶液，以 50m l 的 T B S T 室 温 洗 3 次 ，每 次 5min。 13. 加 入 A P 偶联的抗鼠Ig二 抗 （如用吸头盒盖作容器则加入10ml) ，室温孵育lh，如 步 骤 1 2 以 T B S T 洗 3 次 。 14. 加 入 I O m l 的显色液，孵 育 60s〜15min。当显色信号最佳时弃去显色液，加水终止 反应。也 可 在 15m i n 后将显色弱的条带加入新鲜的显色液继续显色，直至终止反 应 。以水洗涤数次，在滤纸上干燥至仅有少许潮湿。避光保存在塑料夹层中，可在 几天内拍照或保存数月。

        备 选 方 案 使 用 125I 标 记 蛋 白 A 进行检测

        附 加 材 料

        洗液 ：含有 0.5 % O n A O B S A 和 0.2 % (W V ) N P -40 的 T S A 液 30MCi/Mg 125I 标记的蛋白 A (70〜100MCi/iug; ICNBiomedicals)，溶于含有 0.5% (m /V ) B S A 的 T S A 液 （终浓度 0.5|uCi/ml) VTris/盐/叠 氮 化 合 物 （T S A ) 溶液 1 . 如基本方案步骤1〜1 2 进行操作。 2 . 以洗液洗膜3 次 ，每 次 lOmin。本次洗膜及后续的洗膜过程均在室温于振荡器上振荡 进行。 3 . 弃去最后一次洗膜的液体，加 入 30m l 的 O J fXCiAnl125I 标 记 蛋 白 A 。置室温振荡器 上 孵 育 lh。 4 . 弃去125I 标记的蛋白A 溶液 ，以洗液洗膜4 次 ，每 次 lOmin。 5 . 以 T S A 洗 膜 4 次 ，每 次 lOmin。干燥后进行放射自显影。
        ​

        来源：丁香实验

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