T 淋巴细胞增殖实验

相关实验：T 淋巴细胞增殖实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

基本方案 1 未致敏 T 淋巴细胞的活化

材料

R P M I -5和 R P M I -I O 完全培养基反应细胞：未免疫小鼠胸腺、脾脏或淋巴结来源的淋巴细胞（单元 2 . 1 ) 或纯化的 T 淋巴细胞或T 淋巴细胞亚群（单元 2.1 和单元2. 2) 活化试剂（表 2. 11.1) V PBS 辅助细胞：经射线照射或用丝裂霉素C 处理过的（见辅助方案 2 ) 或 T 细胞剔除的（见辅助方案1 ) 小鼠脾脏细胞悬液 3H T d R (附录 3E ) 15m l 和 4m l 聚苯乙烯锥底离心管带 Sorvall H -1000B 转子的低速离心机（或相当于此型的离心机） lml、 5m l 、 IOml—次性聚苯乙烯吸管带盖 9 6 孔平底或圆底培养板（Coster) 25〜IOOiUl单道或多道移液器和一次性枪头 1 . 按照单元2.1所述，用 R P M I -5 完全培养基制备来源于小鼠胸腺、脾脏或淋巴结的反应细胞悬液，收集的细胞数量应保证后续实验所需（每种器官的细胞数量见单元 2. 1 ) 0 2 . 用 15m l 离心管室温， 200g 离心单细胞悬液lOmin，弃上清。 3 . 用 R P M I -5完全培养基重悬细胞团块，计数并用 R P M I -I O 完全培养基调整细胞约为 IO6 个细胞/ml (可参比预实验中每孔2 X IO5、 4 X IO5 和 8 X IO5 个细胞的结果调节细胞浓度），如果用高度纯化的T 细胞或 T 细胞亚群作为反应细胞，需根据激活剂的不同（表 2. 11 . 1 ) 加入相应的非 T 辅助细胞（如 0.1 X l O 5、 0.5 X IO5 或 I X IO5 个细胞/0.1m l 同型脾细胞，加人到 2 X IO5 个细胞/0.1m l 的 T 细胞中，见辅助方案 1)。如果比较不同细胞群体的反应性，需对活化剂和反应细胞进行滴定并做动力学实验。 4 . 按以下方法于室温在4m l 的离心管中配制工作浓度的活化剂。单克隆抗体（如果来

自上清或腹水，至少使用四种稀释度）、毒素（确认使用的小鼠表达能够结合毒素的 1^^[(： 11分子）或凝集素：用？： 83将111^/1111储存液进行四种稀释度，如100] ^/1111、 30Mg/ml、 10Mg/m l 和 3Mg/m l ，由于蛋白质会结合到塑料上，因此稀释后应马上使用。对于药物，用 P B S 配制成合适浓度即可，如 P M A ， lOOng/m l ; A 23187, Iyg/ ml (或 4/xg/m l 离子霉素）。 5 . 加入 2〇 4 各种不同稀释度的活化剂（单抗、肠毒素或凝集素）至 96 孔平底或圆底板中，设置 3 个复孔，如每种激活剂用一行。对照孔加入 20M1 P B S 。由于 P M A 和 A 23187的剂量-反应曲线很窄，所以只需用一个浓度，即加入第 4 步中给出浓度的 2〇 W P M A 或钙离子载体。 6 . 在含有活化剂的9 6 孔板中加入2 X I O 5 个细胞/0. 2m l 。 7 . 将 9 6 孔板置 37°C ， 5 % C 0 2 的培养箱中培养2〜4d (依经验决定培养时间）。 8 . 每孔加入3H T d R ，然后置 C O 2 培养箱中继续培养18〜24h ，用半自动样品收集器收集样品，并用 P 液闪仪检测cpm值。 9a. Acpm值（大部分文献推荐）：用实验组（刺激组）三个复孔的 cpm 平均值减去对照组（未加刺激剂组）三个复孔的平均值，得出实验组的Acpm值。 9b. 实验组和对照组cpm 的比值：实验组 cpm 的平均值除以相应对照组的cpm 平均值 (结果表示为刺激指数或SI)。注：本底的微小变化将引起SI值的很大变化，在分析结果时应特别注意。

备选方案1 用抗体激活未致敏的T 细胞

这种方法适用于当抗C D 3/T C R 复合物抗体不能有效结合小鼠辅助细胞上的F c 受体，或其可溶形式不能有效活化T 细胞时。值得注意的是，在某种抗体（如抗 G 7、Thy-I 单克隆抗体）很难诱导T 细胞增殖反应的情况下，推荐采用基本方案1。

附加材料

P B S (室温和 4°C )

用 P B S 配制 lm g /m l 纯化的抗C D 3 或抗 T C R 单克隆抗体（非特异性活化T 细胞)或 lmg/m l 纯化的抗 V 卩或抗T C R -y S 单克隆抗体（特异性激活 T 细胞，表
2.11.1)

1.在 4 ml聚苯乙烯圆锥底离心管中，用无菌室温 PBS (不含蛋白质）将 lmg/ml无菌的单克隆抗体储存液（表 2.11.1)，根据实验需要配制 4 个浓度的工作液：如lOOug/ml、 10ug/ml、 1ug/ml、 O.lug/ml，临用前配制。

2 .加 30ul各浓度的抗体工作液（每孔最多结合2〜3 ug ; 最佳浓度通常为10ug/ml) 至9 6 孔圆底板中（每种单抗使用一行），用 30/xl P B S 作为对照孔。

3 . 盖好板盖，轻拍培养板侧面确保液体完全覆盖孔底。 37°C 培养 90 min，或者 4°C 培养过夜。培养的同时进行下一步操作。

4 . 同基本方案1 中的步骤1〜3 , 制备反应细胞悬液（可高度纯化，但其中的辅助细胞并不影响实验结果）。

5 . 每孔加入 200ul预冷的 P B S 洗涤上述抗体包被的培养板孔，在超净台中将培养板反转倒扣于吸水纸上轻拍，除去残余的液体，重复洗涤 2 或 3 次，确保除去多余的抗体。

6 . 在洗好的板中加入准备好的细胞悬液2 X 10⁵ 个细胞/ (0.2 ml •孔）（根据经验来确定，不能用杂交瘤上清）。如果细胞暂时未准备好，可加 100M P B S 后置 4°C 保存过夜（加细胞前应去掉P B S )。

7 . 按基本方案1 中的步骤7〜9 进行，在培养 2〜3d 后（进行动力学实验确定最佳时间）加入³H TdR。

备选方案 2 混合淋巴细胞增殖实验

附加材料

反应细胞：未免疫小鼠胸腺、脾或淋巴结的淋巴细胞（附录 2H 和单元 2 . 1 ) 或者纯化的 T 淋巴细胞或T 淋巴细胞亚群（单元 2. 1 和单元 2. 2)。刺激细胞：与反应细胞在H -2或 M l s 位点不同的同种异体小鼠脾细胞，经照射或用丝裂霉素C 处理（见辅助方案 2 ) 或剔除 T 细胞（见辅助方案 1)。照射或用丝裂霉素C 处理可阻断丁细胞摄取3H T d R 。 1 . 按照基本方案1 中步骤 1 〜 3 准备反应细胞。一般来说，需分别稀释成每孔 0.5 X 105、 1 X 1 0 5、 2 X 1 0 5 和 4 X 1 0 5 个细胞，各浓度设置3 个复孔（通常后两个细胞浓度孔可产生最佳的增殖反应），若使用胸腺细胞，需更多的细胞数量（如每孔 1 X 1 0 5、 2 X 1 0 5、 4 X 1 0 5 和 8 X 1 0 5 个细胞）。 2 . 每孔加 0. 55X 105〜4 X 105 个细胞/0. I m l 反应细胞至9 6 孔板，如需要，每个实验组设置 3 个复孔。 3 . 制备经照射灭活或用丝裂霉素C 处理的刺激细胞悬液，或者 T 细胞剔除后的刺激细胞悬液。根据经验来确定刺激细胞的最佳浓度（如每孔 2 X 105、 4 X 105、 9 X 105 个细胞），每孔加 0.1m l 细胞悬液至含有反应细胞的孔中。对照组包括：反应细胞与经照射或用丝裂霉素 C 处理的与反应细胞同基因小鼠来源的刺激细胞的共培养复孔 (本底值）、单独的刺激细胞和单独的反应细胞。 4 . 参照基本方案1 中步骤7〜8 进行，但需培养3〜6d (根据经验确定培养时间）。

辅助方案1 从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T 淋巴细胞

这一方法的主要目的是排除辅助T 细胞的影响。纯化和富集抗原呈递细胞的方法见相关章节；单元 2. 3 中介绍的方法未剔除T 细胞，因此不推荐使用。

附加材料（其他材料见基本方案 1）

与反应 T 细胞同基因的未免疫小鼠脾细胞

H B S S

低毒兔补体（Cedarlane) ，用冰冷无菌的去离子水稀释

抗 Thy-l.2单抗（H 〇 -13-4， A T C C n o . TIB9 9 ) 或抗 T h y-l.l 单抗（H 〇 -22-l ，A T C C n o . TIB1 0 0 ; 或其他抗-Thy-I 单克隆抗体见 C P I M 表 3. 4. 1 和腹水制

辅助方案2 辅助/刺激细胞的灭活

注：当需要检测基因编码的抗原性差异或没有辐射射源时，多数研究者优先采用丝裂霉素 C 灭活细胞。

丝裂霉素C 灭活细胞

附加材料

丝裂霉素C (Sigma，避光保存） 1 . 在铝箔包裹的15m l 试管中，用 P B S 配制浓度为0.5m g /m l 的丝裂霉素C 溶液，并过滤除菌。临用前新鲜配制。 2 . 按照基本方案1 中步骤1 和 2 , 用 P B S 制备 5 X IO7 个细胞/m l 脾细胞悬液。 3 . 加入丝裂霉素C 至终浓度为5(^g/m l ，并用铝箔包裹试管，置 37°C 室温 20min。 4 . 加入过量的R P M I -5完全培养基（大约 12m l 可以加满试管）， 300g 离心 lOmin。弃上清，并重复洗2 遍以上。 5 . 用 R P M I -I O 完全培养基重悬细胞，计数细胞，调整细胞至需要的浓度（见基本方案 1 ，步骤 6)。照射灭活细胞按照基本方案1 中的步骤1〜3 , 用 R P M I -I O 完全培养基制备脾细胞悬液，终浓度为 5 X 106〜20X 106 个细胞/m l 。用辐射源（6 gC o 或173Cs 7-辐射器，如 Gammacel 1000、 Nordion) 1000〜2000rad照射灭活细胞。这一辐射范围适用于大多数免疫学实验中脾细胞的灭活。然而，不同脾脏细胞照射后，其抗原呈递能力有所不同（AshwelUr W .， 1984):低辐射时（500〜IOOOrad)， B

细胞维持抗原呈递功能； 1100〜2000rad辐射后，抗原呈递能力大幅度下降；> 2 0 0 0 m d灭活的 B 细胞失去 A P C 功能。而另一方面，巨噬细胞和树突细胞在 3000rad 照射后依然保持抗原呈递的功能。为确保 B 细胞不参与应答，一些研究者倾向于采用 2000rad。然而，在检测刺激细胞 M l s 位点抗原时，应采用< 1000m d 的辐射，因为此时 B 细胞能够更为有效地呈递 M l s 抗原。另外， M l s 应答也可在丝裂霉素C 处理后进行检测，处理后的 B 细胞依然保持抗原呈递的功能。

在转化的细胞株用作抗原呈递或辅助细胞时，需使用高强度的照射从而阻断其增殖。每种细胞株适合的辐射强度需要根据预实验来确定，但至少应达 5000rad; 某些转化的细胞株可能需要高达 10 〇〇〇〜20 OOOrad，或有些细胞株可能对丝裂霉素 C 更为敏感。