B 淋巴细胞活化的早期事件

相关实验：B 淋巴细胞活化的早期事件

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

基本方案 I BCR 诱导的 B 细胞内钙变化

材料

5 . 将荷载 Indo-I 的细胞转移到一个冰槽中。按每 I.O X lO 6 个 B 细胞加入 1.0/xg FITC- 抗-B 220 (或与藻红蛋白偶联的C D 5、 C D 2 3 或 C D 2 抗体）。在冰上孵育30min，然后用冷 H B S S 漂洗。用含 1 0 % F B S 的冷 IF1 2 重悬。保持细胞在冰上直到使用。如果想要更强的钙信号，在设置了 F A C S 的基准后（步骤 9)，加入生物素化的抗B C R 和 C D 19抗体和 5 倍的亲和素。 6 . 在 37C 水浴中加温30m l 含 1 0 % F B S 的 IF1 2 培养基。将 Indo-I 荷载的细胞、预温的培养基，以及水浴锅带到流式细胞仪所在的实验室。 7•将IOOmI 1.0 X IO6 个细胞转移到另一个 12mm X 75m m 管子并加入 0. 9m l 预温的 IF1 2 / 1 0 % FBS。在 37°C进行热均衡 2min。 8•设定流式细胞仪在350n m 激发 I n d o -I并在 405nm (FL2 ) 与 485nm (F L l) 检测荧光。计算 FL2 (钙结合）与 FL l (钙非结合）的比率。 9• 检测背景紫色光（405n m ) 与蓝色光（485n m ) 的比率共 lmin，然后加入 2/xl l.Ommol/L 伊屋霉素。将管子涡旋混匀然后检测荧光共4min (荧光值将快速升高并达到平台期，随后开始下降。） 10. 重复步骤7 并检测背景荧光值lmin。加入 50Mg 抗 IgM(|u链特异性）或抗 IgD，漩涡混匀，并立即按步骤8 检测荧光比率共5〜8min (荧光值的升高将比使用伊屋霉素的慢）。 11. 可选：为了区别细胞内钙释放与细胞外钙流入，细胞可釆用无钙培养基重悬以用于研究（F B S 也必须透析以去除任何钙离子）。随后，可加入 l.Ommol/L CaCl2来观察细胞外钙内流。 1 2 . 按 C P IM 单元 5. 5 中 Rabinovitch的描述计算钙的浓度。

基本方案 2 蛋白质酪氨酸磷酸化的分析

材料（带 V 项目见附录 1)

V 无血清 IF1 2 或 R P M I 培养基（单元 3. 8) 25fxg/ml F (ab')2抗 IgM (/X链特异性； ICN Biomedicals) n/ I X P B S ， p H 7.2，含有及不含憐酸酶抑制剂（艮 P 10mmol/L N a F 与 lmmol/L N a 3V O 4) ， 4〇 C V 裂解缓冲液（见配方） B C A 蛋白测定试剂（Pierce) V 溶于 I X T B S 丁的 1. 5% B S A (见配方）溶于 1. 5% B S A /1 X T B S T 的 R C 20 : H R P O (BD PharMingen、 Transduction Laboratories) 或 H R P -结合的 4G 10 (Upstate) 抗磷酸酪氨酸抗体 V l X T B S T 溶液增强化学发光试剂盒（Perkin-Elmer Life Sciences 或 Pierce) 稳定素-P 膜（Millipore) 染料木黄酮（可选） 1 . 如前所述（单元 2. 5 中基本方案1 ) 纯化去除红细胞的静息B 细胞。

2 . 于 I.5m l微量离心管内用无血清IF1 2 或 R P M I 培养基重悬细胞至浓度为25 X IO6 个细胞/m l。 37°C静置孵育 30min。 3• 用 25/x g /m lF (&1/)2 抗： ^以刺激静息 B 细胞不同的时间（如 0.5m in、 lm in 、 5min 及 15min) ，刺激过程中细胞保持在37°C 。加入 0.5m l冰冷的含磷酸酶抑制剂的I X P B S ， p H 7. 2 终止反应。 4. 4°C ， 10 O OOg离心 B 细胞 lmin。用 0.5m l 不含磷酸酶抑制剂的I X P B S 漂洗 3 次。用 0.5m l 裂解缓冲液重悬漂洗过的B 细胞。冰上孵育 30min。于 4°C ， 12 OOOg离心 30m i n 去除裂解液中的核碎片和细胞骨架相关蛋白。 5 . 可选：根据厂家说明采用B C A 蛋白测定试剂检测蛋白质浓度。在 S D S -P A G E 胶不同泳道中上样等量蛋白质。 6 . 按单元 12. 3 所述，在还原条件下于1 0 % SDS-P A G E 胶中分离蛋白质。于 200V 电压下电泳3h ，并按单元 12. 5 所述，在转膜缓冲液中转移到稳定素-P 膜上。 7•室温下在摇床上用I .5 % BSA/ 1 X T B S T 封闭膜 20m in。 8 . 室温下在摇床上用1 : 5 0 0 的溶于 I .5 % BSA/1 X T B S T 的 RC20 : H R P O 或 H R P - 结合的 4G 1 0 抗-磷酸酪氨酸抗体孵育膜40m in。 9 . 用 I X T B S T 漂洗膜 3 次，每次 lOmin。最后一次漂洗后，按厂家说明书将膜采用增强化学发光试剂盒中的化学发光试剂孵育。 10. 将膜曝光于放射自显影胶片数秒到几分钟直到在 M O 〜 20k D a 可见清晰的条带 (P L C -7 与 C D 21， 140k D a ; Src 激酶， 50〜56k D a ; Syk 激酶， 70kDa)。刺激过的细胞将比未刺激的细胞观察到更高强度的一系列条带。 11. 用免疫沉淀方法鉴定蛋白质（单元 12. 2)。如果需要，可用静息 B 细胞重复实验来进一步减少背景。同样如果需要， P T K 的作用可通过在木黄酮存在的情况下进行实验来证实。

基本方案 3 细胞大小与 B 细胞活化分子表达的分析

材料（带 V 项目见附录 1)

$纯化的静息B 细胞（单元 2. 5) V 含 5 % (V A O F B S 的 IF1 2 或 R P M I培养基 25|LLg/ml F (ab’)2 抗 M (IC N Biomedicals) 、 1.0Mg/m l 抗 CD40 (克隆 1C1D ; Southern Biotechnology 或 eBioscience) 或 I .Opg/ml LPS (Sigma) V F A C S 缓冲液 10/xg/ml 2. 4G 2 抗 Fe 受体抗体（B D PharMingen 或 A T C C # H B -197) ?1丁0抗鼠-1\/^(： 11类分子化0?1^]\^叫611，义§1 ^ ，或其他公司）：克隆]\110)6 (等位基因特异的）、 14.4.4 (等位基因特异的）及 M 5/114. 5. 2 (种属特异的）， -C D 80 (小鼠特异的）、 -C D 86 (小鼠特异的）或-C D 138 (小鼠特异的）。 V l X PBS (附录 2A ) V 固定液（可选） P E 标记的抗B 220抗体（可选）$