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    方案9 蛋白质的同位素亲和标签实验

    相关实验：质谱在蛋白质组学中的应用实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    实验材料
    透析或沉淀处理蛋白样品
    试剂、试剂盒
    DTT胰酶ICAT 试剂EDTA 三丁基膦Tris

    步骤

    第一阶段 ICAT 标记蛋白

    9. I . 1 材料 注意：标 有 〈！〉的材料的正确处理方法，请参见附录3 。 t l .l.l 试剂 (1) D T T (lmol/L) (2) E D T A (0. 5mol/L) (3) I C A T 试剂 I C A T 试 剂 有 氘 化 （ 重型）和 未 氘 化 （ 轻型）两 种 ，可 以 自 Applied Biosystems购 买 或 自 己 合 成 （ Gygi， etal， 1999)。使用前将其溶解于甲 醇中，甲醇的体积不能多于最后蛋白质溶液体积的1 0 % 。 ( 4 ) 二丁 基 勝 （ tributylphosphine， T B P ) (Aldrich Chemical C o m p a n y ) 〈！〉 如果仅需少量T B P ，可 以 用 丙 醇 （ H P L C 级）I : 1 0 稀释。 警告：该试剂剧毒，需在通风橱中操作。 二 （2-竣乙基） 氯 化 膦 [tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride， T C E P ] 可 代 替 T B P 作为还原剂。 (5) Tris (50mmol/L, pH8. 3) 含 0. 5 % S D S 、 5 m m o l / L E D T A 、 6mol/L 尿素。 ( 6 ) 胰 酶 （ 修饰过的胰酶， P r o m e g a 测序级或类似产品， ljug/fxl) 9. 1 . 1 . 2 生 物 样 品 透析或沉淀处理蛋白样品 9. 1 . 1 . 3 其 他 试 剂 如果进行步骤⑧，则需要第 7 章中方案1 1 所述试剂。 9. 1. 2 方法 ① 在整个实验过程中尤其要注意蛋白质浓度； ② 除非作特别说明，一般要在冰上进行样品操作； ③ 标 记 时 p H 保 持 在 8. 3 左 右 ； ④ 本方案的整个实验过程都要使用等量的蛋白质样品。 ① 将 蛋 白 质 样 品 （300呢）溶 于 50沁 含 0. 5 % S D S 、 5m m o l /L E D T A 、 6mol/L 尿 素 的 Tris (50m m o l /L , p H 8. 3 ) 中 （ S D S 用于溶解疏水膜蛋白。如果样品中不含 此蛋白则不加S D S )。 建议：最好保留1〜2叩未标记的蛋白样品进行电泳，用以检测标记效率 (见步骤⑧） ② 蛋白质溶解后，用 水 1 : 1 0 稀 释 ，并 加 入 E D T A 至 5m m o l /L 。最终浓度为

    第二阶段 阳离子交换清洗 ICAT 样品

    2. 1 材料 注意：标有〈！〉的材料的正确处理方法，请参见附录3。 9. 2. 1.1 试剂 ( 1 ) 缓 冲 液 A ( 2 ) 缓 冲 液 B 1〇111111〇1凡1^氏？ 0 4 ， 2 5 % 乙 腈 ， 35〇111111〇1/乙1^1(?113.〇)。 9. 2. 1. 2 设备 (1) H P L C 柱 （ 如 ， 2. I m m X 20c m ， 5y m 颗 粒 ， 30n m 孔径的强离子交换填料 Polysulfoethyl A ； PolyLC Inc.) (2) HPLC 系统 9.2. 1 . 3 生物样品 IC A T 标 记 的 多 肽 （ 来自第—阶段步骤⑦） 9. 2. 2 方法 ① 组装并平衡阳离子交换柱
    ② 用 缓 冲 液 A 酸 化 样 品 （ 来自第一阶段步骤⑦）， 至 p H ##第三阶段 抗生物素亲和层析分离标记蛋白 <img src=
    ⑪ 向 亲 和 柱 内 加 入 样 品 ，使 溶 液 缓 慢 流 过 柱 子 ，直 至 液 面 略 高 于 柱 床 顶 端 。 ⑫ 然 后 加 1 0 0 沁 的 2 X P B S ，使 溶 液 覆 盖 柱 床 顶 端 。 ⑬ 柱 床 中 的 样 品 孵 育 20min。 9- H 4 清 洗 未 结 合 的 物 质 ⑭ 用 5 倍 柱 床 体 积 的 2XPBS ( p H 7 . 2 ) 清 洗 ，并 开 始 收 集 组 分 。 该 步 骤 可 将 未 结 合 的 物 质 洗 掉 ，随 后 两 步 的 收 集 组 分 可 以 合 并 。 ⑮ 用 5 倍 柱 床 体 积 的 I X P B S 清 洗 ，以 降 低 柱 床 的 盐 浓 度 。 ⑯ 用 6 倍 柱 床 体 积 的 50m m o l /L N H 4H C O 3 (p H 8. 3 ， 含 2 0 % 甲 醇 ） 清 洗 ， 同 时 继 续 收 集 流 出 液 。 N H 4H C O 3 可 进 一 步 降 低 盐 浓 度 ，而 甲 醇 可 除 去 疏 水 性 多 肽 。 A undefined 2 * 5 收 集 生 物 素 化 多 肽 ⑰ 将 第 一 个 肽 收 集 管 置 于 亲 和 柱 流 出 口 下 ，然 后 加 1 倍 柱 床 体 积 洗 脱 液 进 行 洗 脱 ，直 至 洗 脱 液 与 柱 床 顶 端 持 平 。 ⑱ 加 人 另 1 份 柱 床 体 积 的 洗 脱 液 进 行 洗 脱 ，同 时 换 一 个 肽 收 集 管 。 ⑲ 重 复 步 骤 ⑱ 两 次 ，收 集 所 有 4 个 组 分 。 ⑳ 第 1 个 收 集 管 （ 其 p H 为 酸 性 ） 以 及 第 2 个 收 集 管 的 组 分 都 含 有 多 肽 ，应合并 这 两 管 样 品 。 ㉑ 用 质 谱 分 析 多 肽 （ 第 四 阶 段 ）

    第四阶段 ICAT 标记多肽的质谱分析

    义 4. 1 材料 注意：标有〈！>的材料的正确处理方法，请 参 见附录3 。 9. 4. 1.1 试剂 (1) 反相溶剂A 0 . 5 % 乙酸〈！〉， 0.005%七氟丁酸〈！〉， 5 % 乙腈〈！〉 (2) 反相溶剂B 0 . 4 % 乙酸， 0 . 0 0 5 % 七氟丁酸， 1 0 0 % 乙腈 9.4. 1.2 设备 ( 1 ) 离心浓缩仪（ 如 SpeedVac，T h e r m o Savant) (2) 质谱仪 (3) 反相层析柱填料（1〇11111硅胶球， （ ：18颗粒的平均粒径为511〇11 ) (4) R P - H P L C 层析柱 可选用下列型号之一： 50jum 内径/2〇0jLtm 外径 . 75j u m 内径/360jum外径 I O O p m 内径/350/x m 外径
    9. 4. 2 方法 ① 用离心浓缩仪浓缩抗生物素亲和洗脱组分。注意不要使样品完全变干。 ② 14000g•离心15m i n，以使所有颗粒沉淀（ 不应有明显的沉淀）。 ③ 转移上清液至新的试管中。 ④ 加 压 上 样 （ 比例可变）至反相层析柱中，该层析柱与质谱仪在线联用。 上样比例依据样品的复杂程度不同而有所不同，应事先凭经验估计。 ⑤ 用反相溶剂A 清洗反相柱至少lOmin， 以充分除盐。 ⑥ 洗脱样品直接进人质谱仪，洗脱步骤和质谱测定条件设置如下。 流速：反相柱尖端的流速为200〜300nl/min ( 即 H P L C 泵的流速约为 0. lml/m i n ，并在反相柱前进行分流）。 梯 度 过 程 （ 示例）: 溶 剂 B / % 时间/min 0 0 10 5 40 45 80 50 80 55 0 56 0 66 质谱操作条件：全 质 量 谱 （ w/； 2 ：= 400〜1 8 0 0 ) 扫 描 l s ， 若全扫描最强 峰超过阈值，则对该最强峰进行M S/M S扫描。若无强度超过阈值的峰出 现 ，则持续进行全扫描直到出现一个足够强的峰。所设阈值应满足进行 M S/M S分析所需的最低值，如最小 信 号 为 500000计 数 （ count) 。经 MS/ M S 分析过的峰的质量被记人排除名单，以避免在几分钟内质谱重复分析 同一个峰。 毛细管加热温度： 170°C MS/M S 片 段 化 碰撞能量： 27 以 上 参 数 是 基 于 L C Q 离 子 阱 质 谱 仪 （ ThermoFirmiganMATtl San Jose,California) 的 设 置 ，其他类型质谱仪的参数须根据经验稍作改动。

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    来源：丁香实验

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