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        方案6 利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋质混合物

        相关实验:质谱在蛋白质组学中的应用实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        ##一、用于MuDPlT 分析的可溶性蛋白提取物的消化

        1.用 1 mol/L NH4HCO3将蛋白提取物的pH值调至8.5。测定蛋白质浓度(该浓度可作为参考,以确定在步骤⑤和步骤⑦所需要加人的蛋白酶量)。

        2.向蛋白提取物中加入固体尿素,至终浓度为8mol/L。

        3.向蛋白溶液中加入DTT至终浓度lmmol/L,50°C赙育20 min。

        4.将已变性的蛋白溶液冷却至室温,加入碘乙酰胺至终浓度为10 mmol/L,室温避光孵育20 min。

        5.加入内切蛋白酶Lys-C,使底物:酶的比例为100:1,于37℃衅育过夜。

        6.用100 mmol/L(pH8.5)NH4 HC03稀释样品至尿素浓度为2mol/L, 加入CaCl2至终浓度为lmmol/L。

        7.任选下面两种方法之一,将蛋白混合物进行胰酶消化。

        ###方法A:

        (1)加人胰酶,至底物:胰酶为50:1,37°C孵育过夜。

        (2)在微量离心管中以最髙速度离心,除去不溶性物质。

        (3)转移上清至新的离心管中。

        ###方法B:

        (1)每 50ug 蛋白样品中加人约 1ul Porosyzme-固定化胰酶,37°c孵育轻摇过夜。

        (2)在微量离心管中以最高速度离心,除去不溶性物质。

        (3)转移上清至新的离心管中。

        方法B的优点是可减少蛋白样品中的胰酶污染,有利于后续分析。

        8.参照使用说明书,将上清加到 SPEC Plus PT C18固相抽提柱上。将上清用5% 乙腈/0.5% 乙酸置换。

        本步骤很重要,可除去多肽混合物缓冲液中与ESI-MS/MS不相容的盐成分(如NH4HCO3和尿素等)。从样品中除盐非常关键,因为盐可阻止多肽与2D柱中强离子交换树脂的结合,从而使多肽在未与离子交换树脂结合的情况下直接与反相填料结合,结果使 2D-LC 实际上成为一维反相柱。

        通过人为控制,可使多肽中的盐从阳离子交换柱转移到反相介质中。含有 1mol/L 盐的样品无法进行 MuDPIT分析。另外,该抽提柱可用于浓缩样品,这同样重要,因为加入 15ul 的样品到 2D 微型层析柱上约需要 1.5 h。

        ##二、MuDPIT
        方案6 利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋质混合物
        方案6 利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋质混合物


        方案6 利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋质混合物

        来源:丁香实验

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