密 度 梯 度 离 心 法

密 度 梯 度 离 心 法

试 剂 配 制

(1) 淋 巴 细 胞 分 层 液 ：有成品供应，密度为 (1.077±0.001)g/ml。

(2) 台盼蓝染液：见 附 录 2。

操 作 方 法

(1) 取血放入抗凝管，摇匀，用 pH7.2——7.6 的 Hank 缓冲液 (或磷酸盐缓冲液) 稀释血液 1——2 倍 。

⑵ 取 淋 巴 细 胞 分 层 液 3——4 ml，放 入 15 mmxl50m m 的试管中。

(3) 用毛细吸管吸取稀释血液，在离分层液面上 Icm 处 ，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，稀释血液与分层液体积比例约为 2: 1。

(4) 用水平离心机以 2000r/m in 离 心 30 min，离心后其中的内容物分为三层，上层为血浆 (内含血小板)，中间层为分层液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层。

(5) 用毛细吸管轻轻插入到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层的单个核细胞 (图 1.1)，移入另一试管中。

(6) 加 5 倍以上体积的不含 Ca2+ 、Mg2+的 Hank 缓冲液，混勻，1500r/min 离 心 lOmin，吸弃上清，重复洗涤 2 次 。

(7) 末次离心后，吸尽上清，用 含 10% 血清的培养基重新混悬细胞，取 1 滴细胞悬液计数。

(8) 细胞活力检测：取 IxlO6〜 2x l06 个细胞悬液加 i 滴 2% 台盼蓝染液混勻，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。活细胞数应 在 9 5 % 以上。

注 意 事 项

（1）用稀释的全血可使单个核细胞获得率升高，将稀释的血液叠加于分层液上时，一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液的混合而影响分离结果。

（2）配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗、具缓冲作用并对细胞无毒性。

（3）吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染

（4）配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃，后一条件较好，可减少细胞代谢活动。注意不要迅速改变其所处的温度，以 免 造 成 「温度」休克。

备 注

大容量血液可先用甲基纤维素或羟乙基淀粉沉降后，再采用上述方法分离。
将稀释后的血液按 4 : 1 的比例与 0.5% 的甲基纤维素溶液混匀，室温沉降后，吸取上层细胞，离心后，可获得有核细胞，再 以 P B S 稀释，重复上述步骤