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        从肌肉制备丙酮粉用于纯化肌动蛋白

        相关实验:制备肌动蛋白实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 抽提肌球蛋白时得到的沉淀物用 3 倍于沉淀物体积的肌球蛋白抽提溶液抽提 10 分钟。

        肌球蛋白抽提溶液:

        0.5 mol/L KCl

        0.1 mol/L K2HPO4

        2. 抽提物离心(GSA 转头,13000 r/min,17310 g)15 分钟,去掉上清。

        3. 在肌肉残渣中加 1 L 冷的 dH2O,搅拌,然后用 1 mol/L Na2CO3 调 pH 到 8.2~8.5。

        把混和物分到 6 个 250 ml 的瓶中,离心(GSA 转头,13000 r/min,17310 g)15 分钟离下含肌动蛋白的不溶物。

        4. 去掉上清。然后如步骤 3 所述再次离心。倒掉上清并用合适的记号笔画出沉淀物的轮廊(这可以在以后的步骤中确定什么时候沉淀物开始涨大)。加足量冰冷的 dH2O 装满离心瓶以重悬沉淀物。大概重复 4 次直到沉淀物开始涨大。

        5. 沉淀物一开始涨大,不管用水洗的次数是多少,都接着进行下个步骤。

        6. 在 250 ml GSA 离心桶中用冰冷的丙酮重悬肌肉残渣,剧烈搅拌大约 20 分钟。

        7. 离心(CSA 转头,13000 r/min,17310 g)沉淀 15 分钟并去掉上清。此外,沉淀可以在 Bounce 漏斗上过滤。

        8. 重复步骤 6 和 7。

        9. 把沉淀的蛋白铺在滤纸上(例如 Whatman 3MM ) 并让它在室温过夜干燥。

        10. 第二天,如步骤 6 所述的那样,把干了的丙酮粉重悬在氯仿里并离心以去掉多余的脂肪。过滤并干燥沉淀。

        来源:丁香实验

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