叶绿体分离

1. 制备 Percoll 梯度

(1) 两个 50 ml 的聚碳酸酯离心管中分别加入 25 ml 50% 的 PBF-Percoll 溶液。

50% PBF-Percoll

0.33 mol/L 山梨醇

50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0

2 mmol/L EDTA

1 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L MnCI₂

50% Percoll (v/v)

3% PEG 6000 (w/v)

1% BSA ( 无脂肪酸，比如 Sigma 的 A7030）

1% Ficoll (w/v)   

(2) 29000 g（15600 r/min，SS34 转头；Sorvall）离心 15 分钟形成 Pencoll 梯度。

形成的梯度可放 4℃ 过夜。

2. 组织匀浆

(1) 用剪刀收获叶子组织（照上述方法培养，一个平盘可得到大约 100 g 的叶组织），切成碎片，移至 1 L 的塑料烧杯中。

(2) 加入冰冷的研磨悬浮缓冲液。在 4℃ 房间内，用 Polytron 匀浆器（带有 PTA-36/2 mol/L 发生器的 PTA 10/35 型）研磨叶子，每两到三个 5 秒脉冲为一循环，进行 6~7 次循环。

研磨悬浮（GR）缓冲液：

2 mmol/L EDTA 钠盐，pH 8.0

1 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L MnCl₂

50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0

0.33 mol/L 山梨醇

0.5 g/L BSA ( 无脂肪酸）

5 mmol/L 抗坏血酸钠盐（用前添加）

(3) 用两层米拉布（Calbiochem ) 过滤匀浆。将滤液倒入两个 250 ml 的离心瓶中。

3. 2600 g（Sorvall GSA 转头 4000 r/min）离心匀浆 5 分钟。

4. 小心倾去上清。加入 2 ml GR 缓冲液。用一小驼毛刷轻轻的将瓶子内壁的叶绿体刷松。置回转振荡器的冰上振动 5~10 分钟使团块散开。

5. 将重悬浮的叶绿体加到 Percoll 梯度上。10500 g（Sorvall HB-4 转头的 8000 r/min）离心 10 分钟。

6. 抽出梯度介质直到底部的条带。将每一管中叶绿体移至一 50 ml 离心管中，用 1x SH 稀释至 40 ml。2400 g 离心 2 分钟（SS34 转头，4500 r/min）。

7. 用驼毛刷在少量 1x SH 中重悬浮沉淀。将所有叶绿体倒入一个离心管中，稀释至 40 ml，2400 g 离心 2 分钟。

8. 在 1~2 ml 1 x SH 中重悬浮沉淀。

9. 检测叶绿素确定叶绿体得率。

(1) 将 5 μl 叶绿体悬液与 995 μl 80% 丙酮在一微量离心管中混匀。

(2) 13000 g 离心 2 分钟。

(3) 检测 663 nm 和 645 nm 处的光吸收值。

(4) 叶绿素的量（mg/ml） = （8.02 A₆₆₃ +  20.2 A₆₄₅）/5

10. 叶绿体在液氮中的长期保存。

(1) 分离好叶绿体后，立刻用含 20% DMSO 的 1x SH 将最后的沉淀重悬至叶绿素浓度为 3~5 mg/ml。

(2) 冰上放置 10 分钟。

(3) 每 1 ml 为一份，用移液管吸至微量离心管中，快速冷冻，置液氮中保存。

11. 冻存的完整叶绿体的复苏。

(1) 室温融化冻存的叶绿体。用 1x SH 稀释至叶绿素浓度为 1 mg/ml。

(2) 吸取 1~2 ml 含 35% Percoll 的 1x SH 缓冲液到一个 15 ml 的离心管中。其上加入融化的叶绿体。13000 g（Sorvall HB-4 转头，10000 r/min）离心 3 分钟。弃去上清，用 1x SH 洗沉淀。