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        从组织培养皿中的汇合或部分汇合细胞中分离顶层膜、基底膜或中间膜

        相关实验:细胞膜的制备方法实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 制备下列溶液:

        (1) 包被缓冲液(CB)

        20 mmol/L MES

        135 mmol/L NaCI

        0.5 mmol/L CaCl2

        1 mmol/L MgCl2

        pH 5.5

        (2) 1% 溶于 CB 缓冲液的阳离子硅胶

        (3) 溶于 CB 的 1 mg/ml PAA

        用 NaOH 和 pH 试纸调节 pH 值到 5.5。

        (4) 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液

        (5) 70% Nyoodenz,配法同总细胞膜的分离

        2. 准备下列仪器:

        微型离心机

        临床台式离心机

        超离心机

        吊桶式转头和合适的离心管

        5 ml 注射器

        18 G 针头,去掉针尖,磨钝并压扁针头以使之能喷出扇形细滴液体

        橡皮淀帚或细胞刮

        中等大小探头的超声仪

        有碎冰的浅盘

        小铝碟或铜碟:要能放在浅冰盘上以在超声处理过程中支撑培养皿于冰上,能允许较好的热交换以减小冰融化后培养皿倾倒的可能性。

        3. 取生长于细胞培养皿上的汇合或部分汇合的细胞。35 mm 培养皿最好,与细胞汇合后 8 个平皿可以提供 107 个细胞。

        4. 用无血清培养基或含有 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 溶液洗涤细胞 2 次。

        5. 培养皿放到冰盘上的铝碟或铜碟上。用 1 ml 4℃ CB 洗细胞一次。细胞和溶液在以下所有步骤中都要保持 4℃。

        6. 倒掉 CB,加 1 ml 1% CB 溶液中的硅胶以包被顶层膜,放置 1 分钟。

        7. 倒掉硅胶溶液,加 1 ml CB。

        8. 倒掉 CB 溶液,加 1 ml 1 mg/ml PAA/CB,放置 1 分钟。

        9. 倒掉 PAA/CB 溶液,加 1 ml CB。

        10. 倒掉 CB 溶液,短吋间加 1 ml 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液并快速倒掉缓冲液。再加 1 ml 含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液并置冰上 15~30 分钟以溶胀细胞。

        11. 用压扁了的接在注射器上的针头将 1 ml 裂解缓冲液喷洒在单层细胞上,以 45° 角喷射以加以强大的剪切力。

        12. 整个培养皿底部全部处理完成后,将裂解物倒入 50 ml 的锥形离心管中。基底膜在裂解过程中通常会贴附在培养皿底。在处理其他培养皿的时候,用 1 ml 裂解液覆盖基底膜并置于冰上。

        13. 将所有细胞皿中残留的裂解物混合加到第 12 步用过的离心管中。将培养皿立起来以确保取到尽可能多的裂解物。照第 15 步的方法将硅胶包被的顶层膜与中间膜和细胞核分离开。

        14. 用下面两种方法中的任何一种收集基底膜:

        (1) 直接溶于含 2% SDS 的裂解缓冲液中

        ① 往每个平皿中加 0.1 ml 2% SDS,用橡皮淀帚将细胞膜刮起来。

        ② 收集 SDS 溶液并煮沸,直到细胞膜完全溶解。

        (2) 对于需要非变性蛋白的生化分析

        ① 在不含去污剂的裂解缓冲液中用橡皮淀帚将基底膜刮起来,每个平皿用大约 0.1 ml 裂解缓冲液。

        ② 收集所有裂解物到一个离心管中,用微型离心机 14000 g 离心 15 分钟沉淀基底膜。

        ③ 取出并去掉上清,基底膜沉淀可以溶解于 2% SDS 中并煮沸。

        15. 用上述分离总细胞膜方案的 12~17 步中描述的一步或两步法将硅胶包被的顶层膜同中间膜分离。

        来源:丁香实验

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