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        测定[γ-32P]ATP的比活性

        相关实验:透化细胞和退化细胞器中测定比活性实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        准备下列材料:

        含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品

        10mg/ml激酶底物肽渐夜(Calbiochem)

        0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem)

        cA-PrK (Calbiochem)

        cA-PrK分析缓冲液

        lmol/L DTT储存液(^ 2〇尤保存)

        0.5mol/LMg〇2

        75mmol/L 正磷酸

        Whatman P81确酸纤维素滤纸

        丙酮

        循环水浴

        旋涡混合器

        小心:强酸和强喊;IHT;  MgCl2;丙酮(见附录5)

        这_.使用的方法学在下-竹奋更详细的:叙述。CA-PrK分析的细f 4 分析缓冲液和底物的制备/K这里也会讲到2) 将一系列要进行试验的离心管贴上标签。将Wlmt_   P81滤纸切成1英寸的方块,与离心管对应地做上标记(PS1方块的制备见第29节)。

        3) 将离心管放在冰上,加入下列成分

        25^1含 [32P] ATP的裂解液

        5fil l〇x分析缓冲液

        l(il 0.5mmol/L cAMP

        5W 10mg/ml激酶底物肽

        1/zl lmol/L D1T

        l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2

        2^1水

        4) 所有离心管都加好以后,盖上盖子,冰浴。

        5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液,放入301水浴开始反应。

        按这样的时间安排进行实验可以经验件地确定合适的反映时间r 60、120, 180弓200分钟都要试一K,选定的时间应_321~8gt~J掺入激醻底物肽的平台期之后。

        6) 从每管吸出3〇4到对应的P8]滤纸块表面D立即将滤纸放入含75mmoI/L正磷酸的烧杯。所有反应都如此处理过以后,冲洗P81滤纸5分钟。将磷酸溶液倒入装t 32P的废液的容器。再往烧杯中加入正磷酸,搅拌5分钟。如此冲洗P81滤纸5次。7) 往烧杯中加入丙酮,再冲洗5分钟u 倒掉肉酮,让四1滤纸在室温自然晾干:8) 将每一块P81滤纸放入20ml的液闪计数管,用液闪计数器测定放射性。

        来源:丁香实验

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