光学及荧光显微术

一、旋转细胞制备的 Lenkostat 染色

1. 在转瓶小室中加入 100 μl 细胞悬液，500 r/min 离心 2 分钟。载玻片风干至少 5 分钟。

2. 在 Lenkostat 固定液中固定细胞 10 秒：2 mg/ml 孔雀石绿溶于 100% 甲醇。可滴去。

3. 载玻片在 Lenkostat 溶液 1 中浸 10 秒钟使细胞质染色：0.1% 依红；0.1% 甲醛；0.4% 磷酸氢二钠；0.5% 磷酸二氢钾。可用纸巾吸干。

4. 载玻片在 Lenkostat 溶液 2 中浸 10 秒复染细胞质：0.04% 亚甲蓝；0.04% 天青 A；0.4% 磷酸氢二钠；0.5% 磷酸二氢钾。冲去多余染料，风干载玻片。

5. 在光学显微镜下观察确定是否获得了所需染色。如是，可用 Pemount 制作载玻片标本。

6. 如要测定凋亡数量，应放大 40 倍观察。至少应分析包括约 100 个细胞的 3 个视野，给出凋亡和坏死的百分率。

二、悬浮细胞 Hoechst 33258 染色

1. 用 1 μl Hoechst 33258 孵育 100 μl 悬浮细胞 10 分钟。

2. 样品加入转瓶小室中，500 r/min 离心 2 分钟，空气干燥后在细胞上加盖玻片，以减小光衍射，用装备有 DAPI 滤光片的荧光显微镜计数至少 300 个细胞，使用 60 倍物镜。

三、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色

1. 用 1 μl AO/EB 溶液孵育 25 μl 悬浮细胞。轻轻混合。每个样品显微定量前应混合。样品必须立即测评。

2. 置 10 μl 悬浮细胞于显微载玻片上，加盖玻片，用装有荧光滤光片、60 倍物镜的荧光显微镜检测至少 300 个细胞。