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        用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针

        相关实验:用随机寡核苷酸引物从 mRNA 合成 cDNA 探针

        最新修订时间:

        原理

        本方案以 poly(A) + RNA 作为模板,通过随机引物反应合成 cDNA 探针,这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液与溶液

        乙酸铵(10 mol/L)

        DTT (1 mol/L)

        EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0)

        乙醇

        HCl ( 2.5 mol/L)

        NaOH ( 3 mol/L)

        酚:氯仿(1:1,V/V)

        胰 RNA 酶抑制剂(20 单位/μl )

        SDS ( 10% m/V)

        Tris-Cl ( 1 mol/L,pH 7.4)

        2. 酶和缓冲液

        反转录酶

        10X 反转录酶缓冲液

        3. 核酸与寡核苷酸

        含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液

        dCTP ( 125 μmol/L)

        长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物

        模板 mRNA

        4. 放射性化合物

        [α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml,比活性为 >3000 Ci/mmol)

        5. 专用设备

        冰水浴

        Sephadex G-50 离心柱,平衡于 TE(pH 7.6)

        预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板

        二、方法

        1. 将 1 μg poly(A)+RNA 转移至消毒的微量离心管。用无 RNA 酶的水将溶液的体积调至 4 μl。盖紧微量离心管盖,于 70℃ 加热 5 min,然后迅速将离心管转至冰水浴中。

        2. 在微量离心管的冷溶液中加入:

        10 mmol/L DTT                                    2.5 μl

        胎盘 RNA 酶抑制剂                              20 单位

        随机脱氧寡核苷酸引物                          5 μl

        10X 反转录缓冲液                                 2.5 μl

        20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液  1 μl
         
        125 μmol/L dCTP 溶液                          1 μl

        10 mCi/ml [α-32P] dCTP

        ( 比活性为 > 3000 Ci/mmol)                  10 μl

        无 RNA 酶的水                                     加至 24 μl

        反转录酶(200 单位)                          1 μl

        3. 加入下列试剂以终止反应:

        0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)                1 μl

        10% (m/V)SDS                          1 μl

        充分混合管中的试剂。

        4. 在反应管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH,68℃ 温育混合物 30 min 以水解 RNA。

        5. 使反应混合物的温度冷却至室温,加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl(pH 7.4)以中和溶液,混匀,然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取极小量液体滴在 pH 试纸上,以检测溶液的 pH。

        6. 用酚:氯仿抽提纯化 cDNA。

        7. 用离心柱层析或在 2.5 moI/L 醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的 dNTP 分离。

        8. 用三氯乙酸(TCA)沉淀法或 DE-81 滤膜结合法来确定放射性标记 dNTP 掺入的比例。

        来源:丁香实验

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