横向交变场的脉冲场凝胶电泳

Gardiner 等（1986; Gardiner and Patterson 1989) 使用置于垂直凝胶两侧的两组铂线电极的凝胶电泳装置以分离大的 DNA 片段。在这种横向交变场电泳（transverse alternating field electrophoresis, TAFE) 中 ，当电场切换时，DNA 首先移向一组的阳极，然后移向另一组阳极。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

变性缓冲液（0.5 N NaOH，1.5 mol/L NaCl）

含 0.5 μg/ml 溴化乙锭或适当稀释度的 SYBR Gold 的 TAFE 凝胶电泳缓冲液

TAFE 凝胶电泳缓冲液（20 mmol/L Tris-乙酸（pH 8.2)，0.5 mmol/L EDTA）

TE ( pH 8.0)

2. 凝胶

优质琼脂糖

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 分子质量标准

目的基因组 DNA

4. 专用设备

循环水浴

TAFE 凝胶设备

设置 14℃ 的水浴

二、方法

TAFE 分离 DNA 片段

1. 在没有溴化乙锭的 1X TAFE 缓冲液中灌制 1% 的琼脂糖凝胶，待其凝结。制胶所用的缓冲液与充满电泳槽的缓冲液相同。

2. 制备含有目的 DNA 的琼脂糖栓并且进行限制酶消化。制备和包埋 DNA 标准品。

3. 10 倍体积 TE ( pH 8.0) 中漂洗所有的栓 30 min，其间换液两次。

4. 经过消化和洗涤的 DNA 栓分别包埋至凝胶加样孔中，利用 1X TAFE 缓冲液中的溶化的 1% 琼脂糖封住加样孔内的栓。

5. 将凝胶放入含有 1x TAFE 缓冲液的 TAFE 凝胶槽内，缓冲液事先 14℃ 冷却。

6. 接通电源，设置 4s 脉冲，170~180 mA 恒流，电泳 30 min。这一处理使 DNA 迅速入凝胶。此后，降低电流输入至 150 mA，脉冲时间设置为欲分离 DNA 的最适选择，继续电泳 12~18 h。

7. 断开电源，取出凝胶，在含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭或适当稀释度的 SYBR Gold 的 1x TAFE 缓冲液染色。紫外灯下照相。



DNA 变性并转移到尼龙膜

8. 用水洗染色的凝胶两次。洗完两次后倒去水，加入变性缓冲液轻微振摇温育 30 min。 更换变性缓冲液后再温育 30 min。

9. 在变性缓冲液中利用毛细管印迹直接将 DNA 转移到尼龙膜上。

10. 转移后，80℃，2 h 烘烤或紫外交联或微波处理将 DNA 固定在尼龙膜上。

11. 在含有甲酰胺的缓冲液中用标记探针进行预杂交和杂交。