碱性琼脂糖凝胶电泳

碱性琼脂糖凝胶电泳是在高 pH 条件下进行的，它能引起胸腺嘧啶和鸟嘌呤残基丢失一个质子，从而阻止与其各自的配对碱基-腺嘌呤和胞嘧啶间氢键的形成。变性的 DNA 保持单链状态，根据其分子大小在碱性琼脂糖凝胶中泳动。其他的变性剂如甲酰胺和尿素由于能引起琼脂糖橡胶化，因此结果往往较差。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

琼脂糖

10X 碱性琼脂糖电泳缓冲液（500 mmol/L NaOH，10 mmol/L EDTA）

6X 碱性凝胶载样缓冲液（300 mmol/L NaOH，6 mmol/L EDTA，18% (m/V) Ficoll-400 ( Pharmacia 公司），0.15%（m/V) 溴甲酚绿，0.25% (m/V)二甲苯氰）

乙醇

溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液

碱性琼脂糖凝胶中和溶液（1 mol/L Tris-Cl（pH 7.6)，1.5 mol/L NaCl）

乙酸钠（3 mol/L pH 5.2)

1X TAE 电泳缓冲液

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品（通常放射性标记）

3. 专用设备

玻璃板

预置温度 55℃ 的水浴



二、方法

1. 在三角烧瓶或玻璃瓶中加入准确量的琼脂糖粉和定量的水制备琼脂糖溶液。

2. 在烧瓶的瓶颈上轻轻地塞上 Kimwipes 纸。如用玻璃瓶，瓶塞须拧松。在沸水浴或微波炉中将混悬液加热至琼脂糖溶解。

3. 使清亮的溶液冷却至 55℃。加 0.1 倍体积的 10X 碱性凝胶电泳缓冲液，迅速灌制凝胶。当凝胶完全凝固后，置电泳槽中，加入新配制的 1X 电泳缓冲液至恰好盖没凝胶。

4. 用常规乙醇沉淀的方法收集 DNA 样品。加入 10~20 μl 1X 凝胶缓冲液溶解沉淀，再加 0.2 倍体积 6X 碱性凝胶载样缓冲液。

5. 将溶于 6X 碱性载样缓冲液的 DNA 样品加至加样孔中。以 <3.5 V/cm 的电压开始电泳，当溴甲酚绿迁移 0.5~1 cm 时，关闭电源。在凝胶上面放置一块玻璃板，继续电泳至染料迁移了凝胶长度的近 2/3 时，停止电泳。

6. 根据实验目的，按照下面介绍的程序之一处理凝胶。

(1) Southern 杂交

① 将凝胶放在中和溶液室温浸泡 45 min。将 DNA 转移至不带电荷的硝酸纤维素或尼龙膜上。

② 通过相应的标记探针对膜上固相化的 DNA 进行杂交检测。

(2) 染色

① 将凝胶放在中和溶液室温浸泡 45 min。

② 用含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 1X TAE 或 SYBR Gold 染色液染中和过的凝胶。

湿胶的放射自显彩：按下面专栏介绍的一种方法进行操作。