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        低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收(有机溶剂抽提)

        相关实验:低熔点琼脂糖凝胶中 DNA 的回收(有机溶剂抽提)

        最新修订时间:

        原理

        羟乙基修饰的琼脂糖可降低链间的氢键数目,并可在比标准琼脂糖更低的温度下熔化和凝固。多糖链上这种替换发生的程度决定了琼脂糖熔化与凝结的确切温度。这 一特性构成了从凝胶中回收及操作 DNA 的基础(Wielander 1979; Parker and Seed, 1980)。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙酸铵(10 mol/L)

        氯仿

        乙醇

        溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液

        6X 载样缓冲液

        LMT 洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA (pH 8,0))

        酚: 氯仿(1:1,V/V)

        平衡饱和酚(pH 8.0)

        1X TAE 电泳缓冲液

        TE ( pH 8.0)

        2. 凝胶

        低熔点琼脂糖制备凝胶
         
        3. 核酸和寡核苷酸

        DNA 样品

        4. 离心机及转子

        Sorvall SS-3 或等同转子

        5. 专用设备

        手提式长波段(302 nm ) 紫外灯

        预设温度 65℃ 的水浴

        二、方法

        1. 用 1X TAE 电泳缓冲液灌制一块含有适当浓度的低熔点琼脂糖凝胶。

        所以选择 TAE 而非 TBE 有几个理由。主要是 TBE 中的硼酸盐离子能抑制连接反应,并能干扰从玻璃珠上洗脱下来的 DNA 片段的纯化。

        2. 待凝胶冷却至室温后,将凝胶连同支撑用的玻璃板一起移至胶盒的水平表面上。

        凝胶也可以放在冷室以保证凝胶充分凝固。

        3. 将 DNA 样品与载样缓冲液混合,注入到加样孔中,以 3~6 V/cm 的电压进行电泳。

        特定分子质量大小的 DNA 在低熔点琼脂糖凝胶中的泳动速度快于常规琼脂糖凝胶。正因为如此,低熔点琼脂糖所加电压应低于常规琼脂糖凝胶。

        4. 如需要,用溴化乙锭或 SYBR Gold 染色液进行染色。用手提式长波(302 nm)紫外灯确定所需条带的确切位置。

        5. 用一锋利的刀片或剃刀切下含目的条带的琼脂糖凝胶切片,转移至一个干净的一次性使用的塑料管里。

        尽量使切出的琼脂糖切片体积最小,以减少抑制剂对 DNA 的污染量。

        6. 切下条带后,进行拍照,从而获得切出条带的记录。

        7. 加约 5 倍体积的 LMT 洗脱缓冲液至琼脂糖切片中。盖好管盖,于 65℃ 温育 5 min 熔化凝胶。

        8. 待凝胶冷却至室温后,加等体积的平衡酚,将混合液混旋 20 s。在 20℃ 以 4000 g ( Sorvail SS-34 转子 5800 r/min ) 离心 10 min, 回收水相。

        9. 再用等体积的酚: 氯仿、氯仿各抽提1次。

        10. 水相转移至另一新的离心管中。加 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵和 2 倍体积 4℃ 的无水乙醇。混合液在室温下放置 10 min。然后 4℃,5000 g ( Sorvall SS-34 转子相当于 6500 r/min) 离心 20 min, 沉淀回收 DNA。

        11. 用 70% 乙醇清洗沉淀,并溶于适当体积的 TE ( pH 8.0)中。

        低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收(有机溶剂抽提)

        来源:丁香实验

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