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        可被单一限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备实验

        相关实验:可被单一限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体 DNA 的制备实验

        最新修订时间:

        原理

        在某些情况下,制备好的 λ 噬菌体 DNA 经限制酶的简单消化即可用于克隆。但只有当所用载体能用遗传学方法筛选含有外源 DNA 序列的重组噬菌体时(如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10),这种方案才是可行的。因为在这种情况下,不必采取步骤来减少非重组噬菌体的形成。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        ATP ( 10 mmol/L )

        氯仿

        EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0)

        乙醇

        酚:氯仿(1:1,V/V)

        乙酸钠(3 mol/L,pH 7.0)(使用 pH 7.0 而不是常用的 pH 5.2 的乙酸钠非常重要。因为对在消化后用来除去缓冲液中二价阳离子的 EDTA 来说,在 pH 5.2 且浓度超过 5~10 mmol/L 时,将从溶液中沉淀出来。)

        焦糖凝胶上样缓冲液(sucrose gel-loading buffer)

        TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)

        2. 酶和缓冲液

        噬菌体 T4 DNA 连接酶

        带有合适缓冲液的限制性内切核酸酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶(0.7%),用 0.5X TBE,含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

        4. 核酸和寡核苷酸

        λ 噬菌体 DNA

        5. 专用设备

        预置于 68℃ 的水浴

        6. 载体和菌株

        λ 噬菌体包装混合物

        二、方法

        1. 将 25~50 μg λ 噬菌体 DNA 与 TE(pH 8.0)混合至终体积为 170 μl。

        2. 加入 20 μl 10X 限制酶缓冲液。取两份未消化的噬菌体 DNA,每份含 0.2 μg,置于冰浴保存。

        3. 加入 3 倍过量(75~150 单位)的适宜限制酶,按厂家推荐的温度消化 1 h。

        4. 将反应于冰浴冷却至 0℃。再取出一 0.2 μg 的组分,将其与另一份未经消化的 DNA ( 步骤 2) 于 68℃ 温育 10 min,以打断噬菌体 DNA 黏性末端。加小量(10 μl ) 蔗糖凝胶上样缓冲液,立刻将样品加入至 0.7% 的琼脂糖凝胶中。

        如果限制酶消化完全,则没有 DNA 迁移至未消化的对照电泳带处。相反,将会看到两条或更多条(依赖于载体中切割位点的数目)较小 DNA 片段。仔细査看这些小片段的数量确证不存在部分酶切产物。

        这一步并不像听起来那么简单。λ 噬菌体 DNA 的左、右臂带有可互补的长为 12 碱基的末端,它们相互间可发生复性形成氢键,得到的 DNA 很容易与未切断的噬菌体 DNA 相混肴。由于这个原因,当 DNA 样品从 68℃ 水浴取出后应立即上样和进行琼脂糖电泳。

        如果消化不完全,将反应加热至适宜温度,再加入限制酶(50~100 单位),在厂家推荐的最佳温度下继续温育。

        5. 当消化完全后,加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 至终浓度为 5 mmol/L,用酚:氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。

        6. 在 0.3 mol/L 乙酸钠(pH 7.0 ) 存在下,用乙醇沉淀将 DNA 从亲水相中回收回来。于 4℃ 在微量离心机中以最大转速离心 2 min 收集沉淀,用 70% 乙醇洗涤后,将 DNA 重溶于 100 μl TE ( pH 7.6 ) 中,通过测定 260 nm 的吸光率确定其浓度。

        7. 取一份 0.5 μg DNA,如下所述测试其连接能力:

        (1) 用水将 DNA 溶液的体积调整至 17 μl。

        (2) 加入 2 μl 10X 连接缓冲液,如果必要,再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。

        有些商品化连接缓冲液中含有 ATP。如果用这样的缓冲液,就不再需要另加 ATP。

        (3) 取 5 μl 步骤 (2) 中制成的混合物,冰浴保存。

        (4) 在剩余的混合物(步骤(2) ) 中,加入 0.2~0.5 weiss 单位的 T4 DNA 连接酶,16℃ 温育 2 h。

        (5) 用一商品化的 λ 噬菌体包装反应将 0.1 μg 的连接和未连接样品以及 0.1 μg 的未消化载体 DNA 进行包装。

        来源:丁香实验

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