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        大量细菌克隆的杂交方法筛选实验

        相关实验:大量细菌克隆的杂交方法筛选实验

        最新修订时间:

        原理

        这一方法由 Hanahan 和 Meselson (1980, 1983)报道,主要用来处理由质粒 cDNA 文库转化的细菌。将转化菌的混合物或者一份扩增的 cDNA 文库直接置于不含洗涤剂的硝酸纤维素膜或尼龙膜上,复制膜用膜-膜接触的方法制备。采用这一方法,每块 150 mm 板上的 2X104 克隆或每块 90 mm 板上的 1X104 克隆可以被复制,并作进一步杂交筛选。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 培养基

        (1) 含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板。

        本方案中使用 2~3 天旧板效果最好,因为旧板更容易吸收接种物中的水分。

        (2) 含有适当抗菌素和 25% (V/V) 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板。

        (3) 含有氯霉素的 LB 或 SOB 琼脂板。

        氯霉素贮存液浓度应为 170~200 μg/ml。

        2. 专用设备

        平头镊子(如 Millipore 镊子)

        18 号针头

        硝酸纤维素膜(Millipore HATF,或相当产品)或尼龙膜,无菌无去污剂污染

        注射器(3 cc)

        Whatman 3 MM 圆形滤纸。(提前准备一叠 Whatman 3 MM 滤纸(毎一硝酸纤维素或尼龙膜各准备一叠,还要加一些备用品),并裁减成比滤膜稍大一点。一些厂家已有预制好的圆形滤纸出售。用铅箔包好滤纸,高温高压消毒 [ 15 psi ( 1.05 kg/cm2) 10 min ]。

        3. 载体和菌种

        重组质粒转化的 E.coli,用作培养物。



        扩增的 cDNA 文库,生长为培养物。

        二、方法

        1. 用软铅铅笔或圆珠笔在干滤膜上作好标记,用水浸湿后将湿滤膜夹在干的 3 MM 滤纸之间,用铝箔松散地包好,液相循环高温高压消毒 [ 15 psi (1.05 kg/cm2) 10 min]。

        准备足够的滤膜用来从起始板制备 1 或 2 张备份。备份最好用消毒的无菌滤膜,但如果不再从主板制备备份,未消毒的滤膜也可以用。

        2. 用平头镊子将一张消过毒的滤膜,标记面向下,置于含有适当抗菌素的 LB 或 SOB 琼脂板已制备 2~3 天,滤膜完全浸湿后,将其从板上揭下,翻过来标记面向上,再置于琼脂板表面。

        3. 将小体积的菌液置于琼脂板表面的滤膜中心,用一个无菌玻璃棒使菌液分散,在滤膜四周留出 2~3 mm 宽的无菌区。

        大滤膜(直径 137 mm)可提供 0.5 ml 细菌悬液,含 2X104 个活菌;小滤膜(直径 82 mm) 提供 0.2 ml 细菌悬液,含 ~104 个活菌。

        4. 将琼脂板的盖半开(不要倒置)置于通风橱内数分钟使接种物中的水分蒸发,盖上盖子,颠倒琼脂板于 37℃ 培养直至出现直径 0.1~0.2 mm 的小菌落(约 8~10 h)。

        5. 如需要,可在此时按步骤 6 制备备份滤膜,否则按以下步骤使菌落可冻存于 -20℃:

        (1) 将滤膜菌落面向上转移至含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB 或 SOB 琼脂板表面。

        (2) 于 37℃ 培养 2 h。

        如进行 cDNA 文库筛选,最好将主板冰冻。冰冻可减少真菌污染使主板保存数月。含有抗菌素但不含甘油的 LB 或 SOB 板上的主滤膜可在 4℃ 保存 2 周。

        (3) 用 Parafilm 膜封好琼脂板,颠倒置于封闭的塑料袋的于 -20℃ 保存。

        于室温使主板(仍以颠倒位置 ) 解冻后即可制作备份。

        6. 将主膜(硝酸纤维膜或尼龙膜)菌落面上置于无菌的 Whatman 3 MM 滤纸上。

        7. 标记一张湿的硝酸纤维膜或尼龙膜,置于主膜上,防治在两膜之间形成气泡。

        最好将第二张滤膜稍微卷曲,以使两张滤膜首先在中部接触。两膜一旦接触,就不要相互移动。尽量使两张滤膜不要完全重叠,以便于以后使两者分离。

        8. 在滤膜上再盖一张圆形 3 MM 滤纸,并在滤纸上放一个培养皿,用手掌向下紧压培养皿以使细菌从主膜转到滤膜上。

        9. 拿掉培养皿和顶层 3 MM 滤纸,用连接注射器的 18 号针头在双层滤膜作一些空,以作标记方位。

        确保针头剌穿两层滤膜。

        10. 使两膜分开,将备份膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB ) 琼脂板。

        此时,可按步制备第二张备份,用主膜上已有的孔标记第二张备份膜。

        11. 将另一张备份膜和主膜置于新鲜的含有适当抗菌素的 LB ( 或 SOB) 琼脂板,于 37℃ 培养,直到长出菌落(4~6 h)。

        12. 这一阶段,当细菌生长依然很快,滤膜可以转到含有氯霉素的(170~200 μg/ml) 的(或 SOB ) 琼脂板,于 37℃ 培养 12 h。

        13. 将主膜转到新鮮的含有适当抗菌素和 25% 甘油的 LB ( 或SOB ) 琼脂板,而后按步骤 5 冻存。

        14. 裂解附着于备份膜上菌落,将释放出的 DNA 固定于硝酸纤维膜或尼龙膜。进行杂交。

        来源:丁香实验

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