胰岛素剌激的胰岛素受体自磷酸化实验

材料与设备

纯化的鼠肝细胞质膜（见本单元实验 1)

部分纯化的胰岛素受体，得自 WGA-琼脂糖柱层析（见实验本单元 3)

純化的胰岛素受体，得自胰岛素琼脂糖柱层析（见实验本单元 4)

猪胰岛素〔17,5pmol/L(0.1 mg/ml)，溶于 0.001mol/LHCl〕(如 Sigma Chemical Co.13505)

ATP(20 mmol/L;pH7.4)

蛋白质凝胶电泳装置（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

Whatman 3 MM 滤纸

硝酸纤维素膜（Schleicher and Schuell,Inc.)

电泳转移槽（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

一抗（抗磷酸酪氨酸抗体）（单克隆 IgG 2bk;Upstate Biotechnology,Inc.05-321)

二抗〔辣根过氧化物酶（HRP) 标记的抗鼠 IgG;Bio Rad Laboratories〕

ECLTM免疫印迹检测试剂盒（Amersham Life Science,Inc.)

试剂

自磷酸化缓冲液（10x)

起始溶液（10x)

SDS-PAGE 样品缓冲液（5x)

蛋白质印迹转移液

封闭缓冲液

Tris-HCl(10 mmol/L；pH7.4)

NaCl(150 mmol/L)

Tween-20(0.1%)(TBST)

(配方, 见 试剂的配制，pp.234~240)

操作程序

自磷酸化作用

1) 配制如下混合液:



2) 混合液室温孵育 15 min。

3) 加 2ul 20 mmol/LATP 和 4ul 10X 起始溶液，开始磷酸化反应。混合后置室温

解育 15 min。

4) 加 10ul 5xSDS-PAGE 样品缓冲液终止反应。

5) 样品煮沸 5 min。

6) 样品加载于 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，170V 电压下电泳，至染料前沿离开凝胶。（关于 SDS-PAGE 的进一步资料，见附录 5)

将蛋白质转移至硝酸纤维素膜

1) 于凝胶夹的一侧，先放一纤维热（fiber pad), 其上再放一张湿的 Whatman 3 MM 滤纸。

2) 将凝胶放在滤纸的上面。

3) 用水湿润一张硝酸纤维素膜后，将它盖在凝胶上。除去滤纸和凝胶之间的气泡。

4) 再在硝酸纤维素膜的上面放一张湿润的 Whatman 3 MM 滤纸

5) 再铺上另一纤维垫，制成 三明治。

6) 合上凝胶夹。

7) 将凝胶夹放入缓冲液槽中，硝酸纤维素膜面对槽的阳极侧。上述 三明治 应按如下方式排列：

阴极（黑色）

纤维垫

3 MM 滤纸

凝胶

硝酸纤维素膜

3 MM 滤纸

纤维垫

阳极（红色）

8) 槽中充满蛋白质印迹转移液。

9) 置冷室，于 100V 电压下，电泳转移 2 h。

蛋白质印迹

1) 置硝酸纤维素膜于封闭缓冲液中，37℃孵育 1 h。

2) 将硝酸纤维素膜放于有足够量的含一抗（10000 倍稀释的抗磷酸酪氨酸抗体) 的 TBST 液的托盘中，保持膜湿润确保硝酸纤维素膜面对凝胶的那一面向上。

3) 在室温下，摇摆托盘 1~2 h。

4) 用 5 ml TBST 液洗硝酸纤维素膜 5 min。重复 4 次。

5) 加入足够量的二抗（5000 倍稀释的辣根过氧化物酶结合的抗鼠 IgG), 保持硝酸纤维素膜湿润。

6) 置室温孵育 1 h。

7) 用 5 mlTEST 液洗硝酸纤维素膜 5 min, 重复 4 次。

8) 取 ECL 蛋白质印迹试剂盒中的试剂 1 和试剂 2, 等量混合，配制化学发光测定液。

9) 将化学发光测定液倒在硝酸纤维素膜上，反应 1 min。

10) 立即排去多余的试剂。

11) 将硝酸纤维素膜置塑料包装膜内。

12) 加磷光定位斑点（phosphorescentorientationdot)。
注：此步操作时，用 Polymark Natural Glow No. PM 501 很好使，它可在手工艺品商店买到。

13）蛋白质印迹膜曝光 5s、1min 或更长一些时间，直至得到所需的结果。