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        胰岛素亲和层析实验

        相关实验:胰岛素亲和层析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        部分纯化的胰岛素受体,得自 WGA-琼脂糖柱层析(见本单元实验 3)

        NaCl(5mol/L)

        胰岛素琼脂糖(~2 ml 预装胶)(SigmaChemicalCo-)

        一次性小型塑料柱(Bio-Rad Laboratories)

        CentriconTM 浓缩器(Amicon,Inc.)

        银染试剂盒(Bio-Rad Laboratories 161-0449)

        试剂

        溶液 F

        溶液 G

        溶液 H

        (配方,见 试剂的配制,pp.234~240)

        操作程序

        1) 加 0.75 ml 5mol/L NaCl 于经 WGA-琼脂糖柱部分纯化的胰岛素受体溶液(~3 ml) 中,调溶液 NaCl 浓度为 1mol/L。

        2) 用 40 ml 溶液 F 冲洗胰岛素琼脂糖,去除可能影响固定化步骤的所有未偶联的胰岛素。

        3) 将步骤 1 所得的混合液与胰岛素琼脂糖(每毫升受体溶液加 0.5 ml 胰岛素琼脂糖)混合,4℃ 孵育 18 h。

        4) 待琼脂糖达到室温后,将其注入一次性小型塑料柱。室温下用 15 ml 溶液 F 洗柱。

        5) 用 10 ml 溶液 G 洗脱胰岛素受体。分部收集 1ml 组分。

        6) 用本单元实验 2(见 P.212) 所述的胰岛素结合试验法鉴定含胰岛素受体的组分。

        7) 合并有胰岛素结合活性的组分,并用 Centricon 浓缩器浓缩之。这可除去许多水份和去垢剂(辛基β-葡糖苷的胶束大小约为 8000Da)。

        8) 与等体积的溶液 H 混合,将 Triton X-100 重新加入浓缩的受体溶液。为得到高亲和性胰岛素结合活性和高的胰岛素刺激自磷酸化活性,有必要用 Triton X-100 替代辛基β-葡糖苷(Ridge 等,1988)。

        9) 为证实所得产物确为胰岛素受体及其纯度,用 7.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定所分离蛋白的大小(见附录 5)。每孔加约 50ul 样品,其中一孔为分子量标准。电泳后,用银染试剂盒(silver stain plus kit) 对凝胶进行银染。

        来源:丁香实验

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